肝细胞转分化为胰岛素分泌细胞
肝脏和胰腺在胚胎发育时期有着较为密切的联系。胚胎发育过程中肝脏和胰腺都起源于前肠末端，由胚胎内胚层的双潜能祖细胞分化而来，具有发育同源性。有人提出，在原始腹侧内胚层的器官发生过程中，肝脏和胰腺的晚期分离可能使两种组织都具有能够产生肝脏和胰腺谱系的多能细胞。因此，可以想象肝脏和胰腺之间的反式转换。此外，这两个器官具有许多共同特征，包括对葡萄糖的反应，并且在这两个组织中都表达了大量的特定转录因子。
据报道来自不同来源的细胞产生β样细胞的能力取决于它们与β细胞的现有发育相关性。不难发现，肝细胞转分化为胰岛素分泌细胞是一种较有前景的治疗糖尿病的方法。
目前肝细胞转分化为IPCs的方法主要包括转基因法和非转基因法。
转基因法多采用以腺病毒、腺相关病毒或慢病毒等为载体的诱导方法，但是这些方法均存在实验操作烦琐、诱导时间长、成本高等缺点。Lee Yy Na等人将肝细胞反式分化胰岛素分泌细胞形成的细胞片移植，提高了分化效率和移植物存活率。
非转基因法，即化学诱导法，主要用小分子化合物分阶段诱导。小分子化合物具有无免疫原性、可渗入细胞、操作简便、容易合成及保存等优势，并且其对特异蛋白的抑制或激活功能多是可逆的，应用时浓度可以准确控制，使得这种非转基因诱导方法越来越具有优势，近年来已有研究成功使用小分子化合物将各类干细胞分化为胰岛素分泌细胞。例如，南昌大学第二附属医院刘建萍团队成功地首次使用小分子化合物将小鼠肝细胞分化为胰岛素分泌细胞。
（一）小分子化合物对小鼠肝细胞分化为胰岛素分泌细胞的体外诱导作用
Liu等人通过联合 5-氮杂胞苷（5-aza-2¢-deoxycytidine，5-AZA）、曲古抑菌素（trichostatin A，TSA）、维A酸（trichostatin A，RA）、胰岛素转铁蛋白硒（insulin-transferrin-selenium，ITS）及其他细胞生长因子，分三步将小鼠成熟肝细胞成功诱导分化为 IPCs，为糖尿病细胞治疗寻求了一条新途径。
表皮生长因子 （epidermal growth factor，EGF） 是EGF 蛋白家族中的一员，对细胞的存活、增殖及分化起重要作用。已有研究发现EGF可以促进胰十二指肠同源框蛋白1阳性细胞增殖。碱性成纤维生长因子与 EGF 联合使用或单独使用，有利于 IPCs 分化。
激活素A是转化生长因子-β超家族的成员，可调节细胞的增殖和分化，诱导胚胎干细胞向终末内胚层分化，与其他细胞因子联合作用可进一步诱导分化为IPCs。
RA可诱导人胚胎干细胞表达胰腺发育过程中重要的转录因子神经元素3（Ngn3）和神经源性分化因子，并进一步促进胰十二指肠同源框蛋白1（Pdx1）、成对盒基因4（Pax4） 及同源盒基因 6.1（Nkx6.1） 表达，诱导生成 IPCs。
艾塞那肽-4是胰高血糖素样肽 1（GLP-1） 激动剂，可通过刺激β细胞的复制及再生增加 B 细胞团的数量，并可增加胰岛素基因表达及胰岛素原的合成，与利索茶碱共作用时可逆转受损的糖尿病鼠的β细胞。
也有研究报道体外高浓度的艾塞那肽-4可增加小鼠胚胎干细胞来源的IPCs胰岛素的分泌量。艾塞那肽-4与激活素 A 联合作用，可上调 Pdx1、Ngn3，胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽及葡萄糖转运子 2（Glut2） 的表达，这些基因可促进有功能的β样细胞的生成。
5-AZA和TSA在肝细胞向 IPCs 分化过程中起很重要的作用。5-AZA是一种DNA 甲基化酶抑制剂，能刺激胰腺内分泌细胞分化过程中重要转录因子的表达，并能促进胰腺导管细胞向α和β细胞分化。TSA 是一种非特异的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能促进胎胰的发育增加包括 β 细胞在内的胰腺内分泌细胞数量。通过5-AZA及TSA的连续处理，有利于染色体重组，并可进一步促进细胞向胰岛分化。(https://www.daowen.com)
在实验中，这两种小分子化合物的联合使用促进肝细胞的去分化，诱导分化过程中细胞由圆形、卵圆形逐渐向梭形细胞转变即可证明，且在诱导第一阶段肝细胞特异性的标志物 ALB 表达明显下降，出现巢蛋白（Nestin）阳性细胞。
Nestin是一种中间丝蛋白，被认为是神经干细胞的标记物之一，它在多种组织早期发育阶段都有短暂表达。免疫组织化学研究表明，在胎胰及新生儿胰腺的胰岛、腺泡及胰导管细胞中都有Nestin阳性细胞表达，说明Nestin阳性细胞也可能是胰腺前体细胞。有研究表明，通过基因沉默的方法抑制胚胎干细胞中Nestin的表达，可使内胚层及胰腺转录因子表达下降。近年来，已有实验室将骨髓来源的间充质干细胞诱导分化为Nestin阳性细胞，并进一步将其诱导分化为胰腺内分泌及胰导管细胞。因此Nestin可能是胰腺及神经干细胞的共同标记物，实验中Nestin阳性细胞的出现是诱导分化的关键一步。实验的另一个关键步骤是将Nestin阳性细胞在RA及ITS 的作用下诱导分化为胰腺前体细胞，即Pdx1表达阳性细胞。RA对人和鼠胰腺的发育是必需的，其在胰腺的早期发育过程中，特别是在促进人和鼠胚胎干细胞向 Pdx1 表达阳性细胞分化中起重要作用。结合本实验观察结果，RA及ITS联合应用，可诱导Pdx1的表达。实验的最后一步就是将胰腺前体细胞在尼克酰胺的作用下进一步分化为胰岛素分泌细胞。
尼克酰胺是各种诱导方案中常用的一种小分子化合物，早在 20世纪90年代，Otonkoski等就利用尼克酰胺诱导人胎胰向内分泌细胞分化，其研究表明，用10 nmol/L尼克酰胺作用于未分化的上皮细胞簇，可使发育过程中的胰岛β细胞DNA含量增加2倍，胰岛素含量增加3倍，同时，胰岛素、胰高血糖素及生长抑素的基因表达量也增加了。
实验通过直接剪碎肝脏组织获得原代肝细胞，虽糖原染色可见大部分细胞中含有糖原颗粒，但仍有一小部分细胞未着色，通过这种方法获得的肝细胞中可能还存在一些肝脏组织的其他类型细胞，如肝干细胞、胆管细胞等，进一步研究如能通过肝细胞特异性表面标志物用流氏细胞分选的方法获得单一的成熟肝细胞，再用纯化的肝细胞进行诱导分化，在细胞来源上将更有说服力。
小分子物质无免疫原性、可控性强、操作容易，具有广阔的应用前景，并且当前科学技术可以检测出胚胎胰腺发育过程中特异的信号小分子及特异标志物，从而筛选出特异性物质进行特异性的高效诱导。由于胰腺发育微环境复杂，不同阶段需要激活不同的信号分子，即使是同一信号分子在不同阶段也可能起着不同作用。
因此，用不同小分子化合物组合模拟细胞分化微环境可能是诱导的关键，决定着分化效率的高低，或许利用小分子联合基因工程法可能是未来优化诱导方案的更佳选择。
将肝细胞定向诱导分化为 IPCs 研究的目的是将其应用于临床治疗糖尿病。由于胰腺发育微环境复杂，导致分化方案的不规范性及低效性，使得研究者们试图探寻更优的诱导方案。对于这些小分子化合物诱导肝细胞分化为 IPCs 后移植到人体内长期会不会产生副作用，目前还未能监测到的。未来研究者们应致力于探索诱导出高效的有功能和高度选择性的胰岛 β 细胞，为肝细胞应用于临床提供充分的前提保证。
（二）微小RNA在肝细胞向胰岛素分泌细胞转化过程中表达
微小RNA（micro RNA，miRNA）是一类长度约为22 nt的内源性非编码RNA，已被证实参与了许多疾病的发病过程，包括癌症、细菌、病毒感染以及糖尿病。可通过靶向miRNA 或阻止其翻译相关蛋白来抑制基因的表达。 miRNA是哺乳动物基因组中最为丰富的调节基因之一，在细胞发育中起重要作用。miRNA是葡萄糖动态平衡的调节器，在基因表达的转录后调节过程中起关键作用，对胰岛素分泌和胰岛素抵抗有一定的调节作用，同时对胰岛β细胞的分化和再生以及胰岛的发育有重要的调控作用。miRNA在胰腺发育和干细胞分化过程中的动态表达。miR-7和miR-375是胰岛细胞中最丰富的miRNA，在胰腺发育和胰岛细胞功能中起着关键作用。胰腺组织的发育始于最终的内胚层的形成。内胚层的特征是Sox17和Foxa2转录因子的表达。下一步是形成远端前肠内胚层，随后形成胰腺内胚层。在这一阶段，细胞表达相对较高水平的Pdx-1转录因子。在这些细胞中也观察到miR-375的水平。在这个阶段之后，胰腺芽形成，然后发生“头尖—躯干”分离。“尖干”分离包括在“尖”祖细胞的形成中，最终形成腺泡细胞和“干”祖细胞。Pdx-1、Foxa2和Sox9在“主干”祖细胞中高表达。这些细胞也表达高水平的miR-375、miR-15、miR-16、miR-195和miR-7。最后，“躯干”祖细胞分化为导管细胞和胰岛特异性细胞。
基于小分子化合物的作用，刘建萍等人通过改变 miR-124-3p的表达，提高了小鼠原代肝细胞向IPCs的分化效率。 用miR-124-3p模拟物或抑制剂转染肝细胞，然后用化学定义的培养系统使 IPCs 成熟。然后检测分化过程中各阶段胰岛素相关基因的表达和蛋白质及胰岛素的分泌。
miR-124-3p抑制表达组IPCs中Foxa2、Pdx1、NeuroD、胰岛素1和胰岛素2的表达显著上调，而miR-124-3p过表达组结果相反。 miR-124-3p抑制表达组体外细胞免疫荧光和葡萄糖刺激结果显示，胰岛素、Pdx1、C肽表达增加，分化效率高于对照组和过表达组。
研究发现 miR-124-3p 在体外肝细胞向 IPC 的分化中起负调控作用。抑制miR-124-3p表达，显著增加了Foxa2和Pdx1的表达，促进肝细胞向IPCs分化，提高诱导效率。Lu等采用miR-302类似物和表达Pdx1、Ngn3和 Mafa的质粒感染人类肝细胞系HL-7702，通过28天的诱导方案对肝细胞进行诱导，过表达 miR-302可增加胰腺发育相关基因Sox9、Foxa2和内生性Pdx1的表达，最终获得能分泌胰岛素的细胞，其在体外能够对生理性血糖浓度的变化做出反应并释放胰岛素，这表明 miR-302的参与可能在肝细胞转化成胰岛样细胞过程中发挥关键的调节作用。由于肝细胞的来源特殊，如果能发现肝干细胞向IPCs分化过程中起关键作用的miRNA，探索出更加优化的诱导方案，将对糖尿病的治疗起至关重要的作用。