理想标签的主要特征与纯化步骤

（一）主要特征

一般而言，一个用于蛋白纯化和验证蛋白相互作用的理想标签应该具有以下特征：①使结合基质对低浓度目的蛋白有高亲和力；②使目的蛋白比非特异蛋白对亲和物质有更高的结合特异性；③使目的蛋白能高效而且特异性地洗脱；④使洗脱条件适合以保持蛋白相互作用和蛋白复合体结构。

很明显，这些条件在一定程度上自相矛盾，但是在1999年，通过对FLAG、His、Strep、金黄色葡萄球菌蛋白A的两个IgG结合结构域（ProtA）、钙调蛋白结合肽（CBP）、角质素结合结构域（CBD）等筛选，Rigaut等发现ProtA和CBP是最符合上述条件的有效标签，它们能够有效地回收目的蛋白（分别大约80%、50%）。其中CBP标签可以在温和条件下有效筛选目的蛋白，并从亲和柱上释放出来，而ProtA却只有在低pH变性条件下才能从基质结合的IgG上释放出来。根据这些标签的特性研究人员开发了一种新的蛋白纯化串联技术，命名为TAP——Tandem Affinity Purification（串联亲和纯化）。他们在ProtA和CBP之间插入一个特异的TEV蛋白酶识别位点，构建成一个融合标签，命名为TAP标签，可以分别通过ProtA和CBP做两步串联亲和纯化。

（二）纯化步骤(https://www.daowen.com)

纯化一个TAP标签融合的目的蛋白（X）一般包括以下4步（图9-12）：①蛋白所在复合体通过标签上的ProtA结合到IgG珠子；②洗去大部分非特异蛋白之后，TEV酶切后将结合的目的蛋白复合体从IgG珠子洗脱下来；③在钙离子存在的条件下，通过暴露出的CBP结构域，洗脱组分中目的蛋白复合体结合到钙调蛋白包被的珠子上；④洗涤之后，加入EGTA螯合钙离子，使目的蛋白复合体洗脱下来。