8．1 研究意义及方法学概述
8．1．1 研究背景
对人体而言，微量元素都有一个安全和适宜的摄入范围（量），超出此范围，会对机体产生不良影响。不同元素的安全适宜范围是不同的，必需微量元素的生物效应和量与其在人体内的状态有密切关系（图8．1）；而非必需微量元素则应注意其过量时的毒害作用。非必需微量元素在一定含量内对人体影响并不明显，但过量时毒性即增加，甚至最终会导致死亡（图8．2）。
现代工业的飞速发展使得环境污染加重，一些对人体有害的元素如铅、汞、镉等也通过各种途径进入人体，从而对人的健康造成危害。随着化学分析技术与生物化学实验水平的发展和提高，微量元素与健康的研究日益受到医学界的重视，大量临床和实验研究已经阐明，不少微量元素的缺乏与某些疾病的发生有密切的关系。
微量元素在人体内含量虽然极微小，但具有强大的生物学作用。微量元素对生殖系统的影响主要表现在六个方面：①参与生殖系统各种酶的激活和构成；②构成生殖系统的重要载体及电子传递系统；③促进性激素的合成；④减少自由基反应和过氧化作用对生殖系统的损害；⑤维持机体下丘脑－垂体－性腺轴的正常生理功能；⑥营养精子及维持睾丸间质细胞的功能［3］。许多微量元素如锌、铜、锰、铁等与精液质量和男性不育有密切关系。
图8．1 必需微量元素剂量－效应曲线
（a）严重缺乏；（b）显著缺乏；（c）边缘性缺乏；（d）安全与适宜摄入范围（量）；（e）边缘性中毒；（f）严重中毒
图8．2 非必需微量元素的剂量－效应曲线
（a）极毒；（b）中等毒性；（c）微毒
锌是人体必需的微量元素，一定浓度的锌对睾丸的正常发育、精子的形成过程以及精子活力等方面都具有重要影响。动物实验发现缺锌对雄性大鼠的生殖系统生长发育及精子质量有影响，缺锌大鼠的睾酮显著低于对照组，精子密度、活率、穿透力等也均较低［4］。Saaranen等［5］对150名不同精液质量状况男性的研究发现，精浆锌与精子密度有一定的相关性；分析11例精子数量正常（精子密度＞20×106／ml）的男性，其精浆锌与精子总数呈明显的正相关［6］；而在精子密度＜20×106／ml的人群中则没有相关性［7］。但体内锌水平过高也有不良影响。Sanada等［8］的研究表明在精浆锌极低和极高组精液中，正常精子的比例均较低。职业性锌接触的工人中有畸精子症、无精子症及精子无力症发生［9］。
铜也是人体必需的微量元素之一，是机体某些酶的活性成分。用缺铜的食物喂养公羊，1年后发现缺铜严重组的精液量、精子密度均较低，精子活力较差，畸精子增加，补铜后上述各项指标均恢复正常。因此推测，缺铜可以导致睾丸的可逆性功能损伤［10］。目前多数研究认为，铜对精子的作用似乎与锌相反，有损害精子的作用。有资料指出，精子活力差者精浆中铜浓度高［11］。Holland等［12］发现，在37℃时用铜孵育精子3个小时即发现前向运动精子明显降低，且一旦精子处于不运动状态即很难恢复［12］。
锰可通过血－睾屏障，蓄积在睾丸组织中，阻碍各级精细胞的生长发育，导致睾丸组织萎缩、精子数减少、精子存活率降低、畸形精子数增多，并诱发早期精细胞微核增加［13］。陆续培等［14］的研究发现，某矿场身体健康的34名锰接触男工（从事锰作业至少1年）的精液量、精子密度及精子总数均低于对照组（17例无职业接触史对象），而精子畸形率高于对照组。(https://www.daowen.com)
动物实验和对铅作业人群的调查均表明，铅对雄性动物的睾丸有直接的毒性作用，使睾丸生精系统代谢障碍、精子生成减少、形态改变。低剂量染毒组小鼠附睾内的精子数量明显减少，高剂量组精子数量和活动精子数量明显减少，畸形精子数量增加，表明铅对睾丸生精功能和附睾内精子的损害较明显。铅还可使精原细胞正常的分裂受到抑制，造成成熟精子的减少或缺乏；可使生精细胞核变性，线粒体空化，并能通过睾丸屏障，诱发小鼠精原细胞和初级精母细胞染色体畸变；可造成染色体断裂、姐妹染色单体交换、DNA单链或双链断裂或片断缺失、精子顶体反应增加等，从而造成男性生育力的降低［15］。对铅接触男工的影响主要表现为精子密度、存活率和活力的降低，畸形精子数目增加。有研究［16］发现，低铅暴露男工的精子存活率、精子密度均低于对照组，精子畸形率明显高于对照组，而且随着血铅水平和精液铅含量的升高精子畸形率增高；其妻子的自然流产率、死胎死产率及不孕率均高于对照组。
镉对人体也是一种有害元素。镉含量高时可导致精子活动度降低，镉还可以直接抑制精子的氧化酶及直接抑制精子运动器，从而具有明显的杀精作用［17］。在精子密度低于20×106／ml的对象中血镉与精子密度呈负相关，在精子密度20×106／ml以上的对象中相关性不明显［7］，而精浆镉与精液量、精子密度和精子总数均呈负相关［7，18］。但徐德祥等［19］对56名健康志愿者的研究没有发现镉与精液常规指标（精子密度、总精子数、精子活力和畸形率）有相关关系。
机体内所有的元素都存在直接或间接的联系，彼此相互影响，处于平衡状态。研究发现铜、镉与锌有拮抗作用，过多的铜可抑制锌的吸收，并加速锌的排泄；镉也能干扰锌的吸收、置换各种含锌的酶，而锌能减轻镉的毒性［20］。正常人体内多种元素相互间是按一定的比例关系存在的。在人体血清中，锌／铜、镉／锌比值均存在一定的范围，正常人中血清锌／铜比值在0．9～1．27之间［21］，而正常人镉／锌比值较低，精浆中镉／锌比值的上限为14×10－4［22］。
关于血清微量元素含量的检测已有较多的研究，但其测定的元素以必需微量元素如锌、铜较多，而对血清铅、镉含量的测量较少。血清微量元素的含量受自然环境、地区、饮食等多种因素的影响，在人体内的含量有一定的波动。目前关于微量元素与男（雄）性生殖的研究除动物实验外，人群研究中多为对不育人群的研究或不育人群与正常生育男性的病例对照研究，或对职业接触有害因素人群的研究，研究的样本量也较小。在一般人群中微量元素与精液质量的关系并不明确，因此，迫切需要在一般健康人群中开展大样本的关于微量元素与精液质量关系的研究。
8．1．2 研究设计与检验方法
2002年由上海市计划生育科学研究所负责，以中国河北、河南、山西、贵州、浙江和山东六省市作为研究现场对20～60岁一般健康人群进行了“精液质量与环境影响因素研究”（简称“2002年中国男性精液质量研究”）。按照拟定的筛选表筛选合格对象，在对象签署知情同意后进入本研究。由经过统一培训的研究人员进行结构式问卷调查和外生殖器检查，并留取精液和血液标本以进行精液分析和血清微量元素的检测。研究分析了五种血清微量元素（锌、铜、锰、铅、镉）与一般成年男性精液质量的关系，包括：①了解我国一般成年男性血清微量元素锌、铜、锰、铅、镉的水平；②分析血清微量元素锌、铜、锰、铅、镉与一般成年男性精液质量数量上的关系。研究的有效样本为1 179例。
血清标本采集后放入－70℃低温冰箱冷藏，待所有对象的血清标本收集结束后由国家地矿部检测中心承担血清微量元素的统一测定工作。测定元素包括锌、铜、锰、铅、镉五种。元素的测定采用原子吸收分光光度法，测定仪器为TJA－Excell等离子体质谱仪。测试条件为：功率1 350W，冷却气15L／min，载气1L／min，辅助气0．6L／min，样品提升量为1．5ml／min。
检测方法如下：取送检血清样品0．5ml，加3．5ml 1%HNO3和1ml的H2O2静置过夜，在电热板上加热蒸干后加1ml浓硝酸，再蒸干，然后加0．5ml的浓硝酸，呈湿盐状，定容到10ml上机测试。为控制检测质量，检测过程中平均每间隔10个样品做一个平行样，并测试一个标准液，以保证测量的准确性。各血清微量元素标准液回收率平均为：Zn，100．45%；Cu，99．85%；Mn，99．87%，Pb，100．04%；Cd，101．56%。
8．1．3 数据管理与统计分析
根据血清微量元素的分布图，发现血清锌的分布接近对数正态，血清铜的分布近似正态，而血清锰、铅、镉的分布近似指数分布。因此，本研究对血清锌、锰、铅和镉进行了正态转换，转换公式如下：血清锌’＝lg（血清锌）；血清锰’＝ln（血清锰＋1）；血清铅’＝ln（血清铅＋1）；血清镉’＝ln（血清镉＋1）。计算后所得的均数均按相应公式进行回代。对血清微量元素的分布和检测结果首先进行平均水平的描述。由于血清锌、锰、铅、镉为非正态分布，因此在一般性描述分析时采用中位数和四分位数。将血清锌、锰、铅和镉进行正态转换并在转换后计算均数，然后按相应的公式进行回代。
采用单因素方差分析和混合线性模型校正中心随机效应后，比较不同地区、不同人口学特征及不同生活习惯对象的血清微量元素含量是否有统计学差异。采用Spearmen等级相关方法对微量元素间的相关性进行分析。
采用单因素方差分析和混合线性模型校正中心随机效应和禁欲时间的作用，以比较不同血清锌、铜、锰、铅、镉组的精液量、精子密度、精子存活率、精子前向运动率和精子正常形态率是否有统计学差异。最后将精液质量主要指标精液量、精子存活率、精子前向运动率和精子正常形态率按WHO推荐的精液质量参照值转换为两分类指标；由于精子密度不符合WHO推荐参照值的比例较低，因此对精子密度采用四分位数（P25，P50，P75）分为四个等级，形成两分类或有序多分类指标，以此为因变量；拟合血清锌、铜、锰、铅、镉与精液质量指标的logistic回归模型，以及调整其他可能影响因素后的多因素logistic回归模型，以探讨血清锌、铜、锰、铅、镉对精液质量的影响。
