Prx l-Cre和Prx l-CreER

Prxl被认为是调节四肢骨骼发育的必要基因，并由骨形态发生蛋白 (BMP)介导的信号通路调控。Prxl-Cre转基因小鼠是由哈佛医学院遗传学部的Malconlm Logan及其同事首次构建的［16］。如图2-4所示，Cre重组酶基因在转录水平由2.4kb配对相关同源框1(Prxl)增强子调控，并包括β-珠蛋白绝缘子序列 (β-globin insulator)，以及 0.7kb猿猴空泡病毒 40聚腺苷酸化序列(SV40 PA)。(https://www.daowen.com)

Prxl-Cre转基因小鼠已被应用于骨软骨祖细胞分化的相关研究中。Seo HS等人在Prxl-Cre小鼠中特异性地敲除β-转化生长因子Ⅱ型受体 (TGF-βRⅡ)，结果显示TGF-βRⅡ是骨骼正常发育的必要因子，并可抑制间充质干细胞向软骨细胞分化［17］。Soung DY等人通过Prxl-Cre小鼠研究Runxl因子在骨骼发育及骨折愈合中的功能，结果显示Runxl对于软骨祖细胞向软骨细胞的分化至关重要，并可剂量依赖性地调控软骨内骨化及骨折愈合过程［18］。Bruce SJ等人则发现India Hedgehog基因 (IHH)受体Ptc1的敲除可抑制软骨细胞的正常分化［19］。

图2-4　Logan等人合成的Prxl-Cre转基因结构

美国凯斯西储大学的Kawanami等人，通过将CreERT2和GFP报告基因插入至鼠源2.4kb的Prxl启动子的下游基因中，构建了Prxl CreER-GFP转基因小鼠 (图2-5)［20］。这种小鼠能够在2.4kb的Prxl启动子的调控下在骨膜细胞中同时表达CreER和GFP基因，从而使得Cre的表达不仅受到Prxl启动子调控，并且含有GFP报告基因，便于进行细胞筛选。一旦经过他莫昔芬的诱导，CreER会转位至细胞核中，并与位于loxP位点之间的基因重组。如果说CreER的表达使得loxP位点之间等位基因的重组得以在时间上被调控，那么GFP报告基因则可通过细胞筛选区分表达转基因的细胞及其他骨膜细胞。通过这种转基因小鼠，他们发现表达Prxl CreER-GFP的细胞同时具有向软骨细胞和骨细胞分化的潜能［20，21］。

图2-5　Kawanami等人合成的Prxl CreER-GFP转基因结构

Osx-CreER是通过将Cre-ERT2的融合蛋白cDNA及下游多聚-A(pA)元素克隆至Osterix基因启动子中构建而成的 (图2-6)。将此种可通过他莫昔芬诱导的Osx-CreER转基因小鼠与Rosa26报告小鼠杂交，可用来追踪成骨细胞系不同分化阶段细胞的命运。脉冲追踪研究表明，那些表达Osterix基因的骨细胞始祖细胞，在软骨血管侵入前即分布于骨膜中，并在骨的发育过程向松质骨细胞、成骨细胞及间充质细胞分化［22］。

图2-6　Osxl-CreERT2转基因结构

Chen和Long等人通过在特定时间向新生小鼠注射他莫昔芬，得以在其体内表达Osterix基因的细胞中敲除β-catenin基因，并由此证实Osx阳性细胞中的β-catenin基因通过促进成骨细胞活性，抑制成骨细胞代谢，并抑制破骨细胞活性，以及抑制骨髓腔内脂肪的形成，对维持骨稳定具有至关重要的调控作用［23］。