TRAP-Cre和Ctsk-Cre

破骨细胞是介导骨吸收过程的功能细胞，其活性与血钙浓度的调节紧密相连。当血钙浓度降低时，破骨细胞介导的骨吸收可通过释放钙离子而维持其浓度稳定［15］。临床上破骨细胞活性增高是造成骨质疏松的重要原因，因此抑制破骨细胞的活性也是包括双磷酸盐在内的治疗骨质疏松药物的主要靶向［57］。基于破骨细胞的功能，针对破骨细胞的Cre系统可为进一步研究骨吸收通路提供有效工具。墨尔本大学医学院的Chiu及其同事将两种破骨细胞因子——抗酒石酸盐酸性磷酸酶 (TRAP)和组织蛋白酶K(CtsK)的启动子区域，分别用于破骨细胞特异性Cre的表达［58］。TRAP催化骨吸收中众多酯类和酸酐的水解［59］，而CtsK是分解Ⅰ型胶原的溶酶体半胱氨酸蛋白酶［60］。

TRAP-Cre和Ctsk-Cre小鼠均通过特异性基因构造的转基因集合而生成。如图2-16所示，TRAP-Cre结构由包括1B外显子和1C外显子在内的TRAP启动子区域片段及Cre cDNA合成。Ctsk-Cre通过pGL3-CK5.0质粒合成，此质粒中CtsK基因启动子-3359 至+1660的核酸序列与Cre cDNA相融合，并通过与TRAP-Cre相似的修饰方法合成Ctsk-Cre［58］。

R26报告被用于对Cre小鼠的验证。Ctsk-Cre小鼠中Cre在长骨、颅骨和肋骨中中度表达，并在包括肝在内的少量非矿化组织中存在低表达，此外长骨的组织学检测显示破骨细胞的X-gal阳性染色，而极少量骨髓细胞的阳性染色表明Ctsk-Cre也表达于破骨细胞的晚期。TRAP-Cre的分析显示出β-gal的高量表达于长骨、脊柱、肋骨和颅骨中，然而在肝和心脏等少数软组织中同样检测出非特异性X-gal阳性染色。此外，组织学结果显示，βgal不仅表达于长骨的破骨细胞中，也表达于生长层和肥大层软骨细胞中。简言之，Cre表达水平因转基因的集成位点而异。Ctsk-Cre能够更特异性地表达于破骨细胞中，而TRAP-Cre表现出更高的Cre表达水平，二者均可在破骨细胞中表达Cre的活性［58］。除此以外，Ferron和Vacher也合成出CDl lb启动子调控的Cre。这些小鼠在骨髓和破骨细胞的分化中表达Cre的活性［61］。

图2-16　TRAP-Cre和Ctsk-Cre转基因结构

Nakamura及其同事建立了另一种Ctsk-Cre转基因小鼠，其中Cre的编码序列通过重组工程被敲入位于内源性ATG位点后的内源性CtsK基因座中［62］。这一转基因小鼠被用于破骨细胞特异性雌激素受体α的研究中［63］。

综上所述，这些转基因修饰特定细胞类型的小鼠模型，为在某种或多种特殊细胞中条件性敲除特定基因提供了重要的工具。Xiong等人近期的研究正是极好的例证［10］。RANKL对于破骨细胞的分化至关重要，然而究竟何种细胞分泌RANKL以促成破骨细胞形成尚存在争议。长期以来，成骨祖细胞支持破骨细胞的形成成为主流论点，然而组织学研究从未在破骨细胞周围发现成骨细胞或成骨祖细胞的存在。阿肯色大学医学院的Xiong等人将Cre-lox系统用到了极致，他们建立了Prxl-Cre、Osxl-Cre、Ocn-Cre及DMPl-Cre等一系列RANKL基因敲除小鼠，最终证实在成年鼠的骨重建过程中，骨细胞是成骨细胞系中分泌RANKL的主要来源［10］。