CreER系统的细胞命运研究

骨髓间充质干细胞模型显示，在骨髓腔中存在具有自我更新能力的干细胞，可分化为骨骼发育、稳定及修复所需要的成熟的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及骨髓间充质细胞。内源性骨髓间充质干细胞的主要来源是包围在骨髓窦状隙内的间充质干细胞［64］。窦状隙周间充质细胞在小鼠体内呈Nestin(Nes)　-GFP［65］和瘦素受体 (Lepr)　-Cre［66-68］阳性表达，而在人体内则呈CD146阳性表达［69］。了解这些间充质干细胞的最终来源，以及在胚胎时期和生长后期的骨系祖细胞之间的关系至关重要。近年来，他莫昔芬诱导的CreER系统被用作有效的家系追踪系统。除了以上提到的Col 2-CreER以外，Nestin-CreER、Gremlin-CreER、Sox 9-CreER，以及Osx-CreER系统，均被用作间充质干细胞家系追踪。

Nestin阳性的间充质干细胞含有所有骨髓克隆形成单位的成纤维细胞活性，并且可作为非黏附性的、有自我更新能力的 (“mesenspheres”)细胞，这种 “mesenspheres”细胞即使经过数次移植，仍可保持自我更新及增殖的能力［65］。Worthley等人将Nestin-Cre-ER转基因小鼠［70］与R26-LSL-TdTomato报告的小鼠杂交，在他莫昔芬的诱导下追踪Nestin阳性间充质干细胞的分化潜能。对新生小鼠 (P1)注射他莫昔芬诱导后6～8周的追踪显示，Nestin阳性的间充质干细胞分布于骨干骺端、关节周边及窦周间隙处。然而，Nes-CreER标记的细胞在这6～8周的时间内并没有生成软骨组织或者松质骨，只有个别的成骨细胞被包埋于骨干处的皮质骨内。这些发现显示，窦周间隙处的Nestin阳性间充质干细胞可能不是胚胎发育或者早期生命的主要的骨骼系统祖细胞，至少8周小鼠体内的Nes-CreER追踪系统没有捕捉到Nestin阳性细胞分化成为骨系祖细胞的迹象［71］。

Greml的表达可用来判断骨髓基质细胞中最具克隆力的细胞群［72］。相较于内源性骨髓间充质而言，未分化的间充质培养中Greml的表达水平更高。Worthley等人通过构建Grem lin-CreER转基因小鼠，得以将这些发现应用于体内研究［71］。这种转基因小鼠具有在他莫昔芬诱导下特异性表达Greml基因的CreERT结构。成年鼠的Greml阳性细胞并不具备Nestin基因的阳性表达，且无论在体外或是体内培养中，均不能分化为Nestin阳性细胞。早在P1小鼠经诱导后的4周后 (P28小鼠)，Greml阳性细胞即可分化为骨干骺端及骨骺端接近64%的骨细胞和50%的软骨细胞，然而在骨干处几乎没有Nestin阳性细胞分布。因此，作为特定的早期骨软骨祖细胞，这些Greml阳性细胞被称为是骨软骨网状 (osteochondroreticular，OCR)干细胞。(https://www.daowen.com)

Osx启动子支配下的CreER重组酶标记细胞后，可通过在胚胎发育时期 (E13.5)及生长发育时期 (2周和13周)注射他莫昔芬诱导，识别Osterix阳性细胞的分布。Miszoguchi等人描述了在不同生长发育时期他莫昔芬诱导，骨髓中Osterix阳性细胞表现出的三种不同的分布。在胚胎发育时期 (E13.5)注射他莫昔芬，胚胎期骨髓中的Osterix阳性祖细胞可分化为初生骨组织及短暂的间充质细胞，这些细胞在成年骨髓中被其他细胞所替代。出生2周时注射他莫昔芬，新生期骨髓中表达Osterix的细胞可分化为骨系细胞及长期存在的骨髓间充质。出生13周时注射他莫昔芬，在成年骨髓中，只有骨系细胞才呈现Osterix标记，而在间充质细胞中呈阴性［67，72］。Ono N等人［28］进一步表明，骨干骺端和骨干处Osx阳性前体细胞的来源并不相同。出生3天时 (P3小鼠)注射他莫昔芬，小鼠骨表面的大部分成骨细胞及软骨膜中的细胞都呈现出Osx-CreER标记。经过1个月的追踪，这些Osx阳性细胞分化为骨干骺端和骨干处的成骨细胞及间充质细胞，但并不包括骨骺处。一年之后，这些细胞逐渐从骨干骺端消失，更多地作为骨干处骨髓中的间充质细胞，以及ednocortical表面处成骨细胞的形式存在。因此，P3小鼠中标记为Osx-CreER阳性的细胞只是短暂地存在于骨干骺端，但却长期存在于骨髓间充质中。

Sox9-CreER转基因小鼠被用来追踪生长早期表达Sox9基因的细胞结果显示，Sox9+细胞是骨干骺端Osx阳性细胞的前体［28］。Sox9-CreER标记的细胞同样具备Col2-CreER及Aggrecan-CreER的阳性表达。这群软骨细胞系的细胞为骨骼的生长发育提供了早期间充质祖细胞。当骨骼快速发育的时候，这群Sox9+Col2+Acan+细胞能够自我更新，并为骨干骺端Osx阳性细胞前体提供了稳定的来源，这些前体细胞将在至少6个月内持续产生骨细胞及基质细胞［28］。