组织形态学检测分析

1.阿尔辛蓝/橙黄G染色 (Alcian blue/Hemotoxylin&orange G，ABH染色) 右侧胫骨骨折标本放入10%NBF中浸泡3日以达到充分固定。固定后用去离子水冲洗3～5次，然后用14%EDTA溶液脱钙处理14天，每隔一天换液。脱钙完成后，同样用去离子水冲洗3～5次，然后经樱花全自动脱水机处理后用石蜡包埋。切片时，骨折线与刀片呈水平位，以3μm厚度切片。烤片后进行染色。阿尔辛蓝/橙黄G染色：二甲苯脱蜡3次，每次5分钟；100%、95%、85%、70%乙醇各5分钟，样本复水；1%盐酸/乙醇30秒，1%阿尔辛兰/苏木素30分钟，1%盐酸/乙醇2秒，0.5%氨水15秒，95%乙醇1分钟，橙黄G/伊红染液1分30秒；再依次浸入70%、95%、100%乙醇进行脱水；二甲苯透明处理后，用中性树脂封片，在光学显微镜下观察。

骨折后第7、10、14、21天在光学显微镜下观察骨痂部位、形态、性质 (软骨骨痂或骨性骨痂)　(图8-6)。骨折后的第7天，骨痂两侧皮质骨区域骨膜增厚，硬骨痂形成，骨痂中央的软骨内成骨区域的间充质细胞逐渐分化为软骨细胞，一部分软骨细胞肥大化；骨折后第10天，软骨骨痂明显增多，大多数软骨细胞处于肥大化阶段，开始进入软骨内成骨时期；骨折后的第14天，大部分软骨细胞被破骨细胞吸收，软骨开始钙化；骨折后的第21天，骨痂区域充满大量的类骨质，膜内成骨区域则为编织骨阶段。

图8-6　小鼠骨折术后7、10、14、21天骨痂ABH染色

2.骨组织形态计量学分析 连续切片后，每间隔10张片子选择2张，共选择3张切片供骨组织形态计量学分析。光学显微镜下观察骨痂部位、形态并拍摄高清照片，切片放大倍数为100倍。利用Osteo-measure软件进行组织形态计量学分析，着重记录切片内软骨骨痂面积和新生骨的骨痂面积 (mm2)(n=5)。骨痂区域选择如图8-7所示。

图8-7　骨痂骨形态计量学分析选择区域