基因的表达分析

软骨及成骨相关标志基因表达水平检测。

1.骨痂的获取及储存 所有操作应尽可能减少RNA酶对RNA的降解。小鼠断颈处死。取一泡沫垫，其上覆盖无菌单，小鼠取仰卧位于无菌单上。迅速用剪刀沿原切口瘢痕剪开皮肤，暴露胫骨及骨折部位。按照前面所述方法获得开放性胫骨骨折术后标本。用持针器拔除胫骨内髓内针，并用11号尖刀片轻轻劈开骨折断端。轻柔切除骨膜下骨痂及断端间骨痂并放入DEPC水处理后的PBS溶液中。用注射器反复冲洗，尽量将骨痂上的血液清除，同时用尖刀片轻柔分离清除贴附于骨痂上的骨膜。将处理好的骨痂放入1.5mL离心管中并迅速储存于液氮中。待所有骨折标本处理完毕后，可将所有离心管从液氮中取出，并迅速转移至-80℃冰箱中冻存待用。常规分析术后第7、10、14、21、28天的骨折标本。

2.骨痂组织mRNA的提取 所有操作在冰上进行。取2mL微聚离心管，向其中加入一颗直径为5mm的不锈钢钢珠，并加入之前冻存的骨痂组织。向离心管中加入1mL TRIZOL。将离心管放入QiagenTissuelyser的配套支架上，以20Hz的频率剧烈震动5分钟。从支架上取下离心管，冰上静置5分钟。打开离心管，加入0.2mL氯仿，并剧烈摇晃15秒。冰上静置3分钟。4℃环境下12000×g离心15分钟。将上清液转移至新的无酶离心管，并向其内加入0.5mL异丙醇，充分混匀并静置10分钟。4℃环境下12000×g离心10分钟。吸除上清液。加入1mL75%乙醇，4℃环境下7500×g离心5分钟。吸除上清液后，即初步获得骨痂组织mRNA。用RNeasy Plus Mini Kit按照试剂盒内指导提纯mRNA。

3.mRNA的浓度测定与逆转录 取1μL所获得的mRNA放置入超微量紫外分光光度仪核酸定量分析仪中进行浓度测定，然后取1μgmRNA按照iScriptcDNASynthesis Kit内操作指导配制反应体系合成cDNA。(https://www.daowen.com)

4.Real-time PCR定量分析基因 取同批次cDNA，假设浓度值，梯度稀释后，作为模版，与其他样本cDNA同时进行PCR反应。通过Rotor Gene 6.0软件自动生成标准曲线，将样品检测荧光值代入标准曲线，自动进行半定量分析。统计数值以目的基因拷贝数/β-actin拷贝数表示。常用的软骨相关特异性基因：Sox9、Col2αl、Coll0αl；成骨相关特异性基因：Runx2、Osterix、Osteocalcin(引物序列见表8-1)。

表8-1　Real-time PCR引物序列

续表