LRP5突变活化小鼠模型的建立

Babij等通过聚合酶链反应 (PCR)将G到T(G171V)突变引入人的LRP5的cDNA(GenBank登录号AF077820)，通过DNA测序确认后，连入大鼠I型胶原启动子(3.6 kb)下游位置，cDNA下游为SV40内含子和多聚腺苷酸盒。对照组即将突变的人LRP5替换为野生型人 LRP5序列，采用标准微量注射法将 DNA注入C57BL/6Tac小鼠胚胎。子代小鼠经PCR鉴定基因型：引物为Forward primer，5'-GAATGGCGCCCCCGACGAC-3'(LRP5 nucleotides 4692-4710)；Reverse primer，5'-GCTCCCATTCATCAGTTCCATAGG-3'(SV40 nucleotides 4541-4564)。检测到524 bp大小的转基因的特定连接片段，采用免疫印记检测基因组DNA经转基因整合的完整性。采用Real-Time PCR检测股骨及胫骨组织中LRP5的表达。在人HOB-03-C5细胞及小鼠MC-3T3-E1细胞中检测内源性LRP5的特异表达。人及小鼠LRP5 cDNA种属特异性引物及探针序列如下。

Human LRP5：Forward primer，5'-CGTGATTGCCGACGATCTC -3'(nucleotides 2605-2623)；Reverse primer，5'-TTCCGGCCGCTAGTCTTGT-3'(nucleotides 2703-2721)；

探针：6-FAM-5'-CGCACCCGTTCGGTCTGACGCAGTAC-3' (nucleotides 2635-2650)。

Mouse LRP5(GenBank登录号：AF064984)：Forward primer，5'-CTTTCCCCACGAGTATGTTGGT-3'(nucleotides 4372-4393)；Reverse primer，5'-AAGGGACCGTGCTGTGAGC-3'(nucleotides4396-4424)；(https://www.daowen.com)

探针：6-FAM-5'-AGCCCCTCATGTGCCTCTCAACTTCATAG-3'(nucleotides 4434-4452)。

同时检测内源性小鼠I型胶原表达，引物如下：Forward primer，5'-TGCTTAGTTTTGCCCGCC-3'；Reverse primer，5'-GTAATGATGAGTTAACCACGCCC-3'；

探针：6-FAM-5'-TTGCCTTGATCAGGTCCTGGAGCG-3'。

处死小鼠后，将右侧股骨用70%乙醇固定，进行骨量及组织学检测。左侧股骨及第5腰椎行生物机械强度测定。