参考文献
第十三章 放射性颌骨坏死的动物模型
放射性颌骨坏死（ORNJ）是口腔颌面头颈部恶性肿瘤放疗后常见的严重并发症。ORNJ以颌骨及周围软组织在放疗后发生进行性坏死及感染为主要特征，临床上主要表现为局部红肿、疼痛、张口受限、死骨暴露，严重者可出现病理性骨折及口腔与面颊部洞穿性缺损等症状，严重影响患者的生存质量，目前尚无有效的防治手段，究其原因是对发病机制的研究不明确，因此建立理想的放射性颌骨坏死动物模型是探究ORNJ发病机制及防治方法的核心与关键。
一、实验动物选择
理想的实验动物模型应具备如下特点：能够有效地模拟人类疾病的发生发展过程及病理生理特点；建模成功率高，建模过程中实验动物死亡率低；操作过程简单，重复性高等。目前，国内外学者致力于建立理想的放射性颌骨坏死动物模型，对于实验动物种类选择也不尽相同，主要包括啮齿类动物中的鼠、兔类等，大型哺乳类动物中猕猴、犬、山羊、小型猪等。
（一）啮齿类动物
啮齿类实验动物模型具有生长周期短、代谢快等优点，是应用最广泛的实验动物模型，且遗传背景、品系品种明确，费用相对低廉。但是此类实验动物模型颌骨量小，口内操作困难，难以进行同一个体颌骨双侧对照研究等因素限制了成为理想的放射性颌骨坏死动物模型。
（二）大型哺乳类动物
近年来，大型哺乳类实验动物成功建立了许多人类疾病动物模型。猕猴属于灵长类，是人类的近属动物。其颌骨的解剖形态与组织学特点最接近于人类。但价格昂贵，实验成本过高，常由其他实验动物代替。犬类及山羊颌骨形态、结构和局部组织解剖特点与人类接近，性情温顺，便于实验操作，小型猪除了具备上述优点外，还具备乳恒牙两套牙列，且颌骨骨量大，易于获取组织和进行多时间点的连续性观察研究。
二、放射性颌骨坏死动物模型建立技术和方法
（一）照射方式
照射方式一般分为内照射和外照射。内照射一般将放射性核素植入实验动物颌骨区域进行短距离大剂量照射，因操作难度较大，ORNJ动物模型一般采用外照射方法，外照射可分为单次高剂量照射和分次低剂量照射。外照射技术以三维适形放疗（three-dimensional conformal radiation therapy，3DCRT）、调强放射治疗（intensity modulatedradiation therapy，IMRT）及图像引导放疗（image guided radiation therapy，IGRT）三种放疗新技术为主，在保证实验动物放疗靶向区高剂量照射的同时，极大程度地保护照射区域周围重要的解剖结构。
（二）照射剂量
颌骨接受的照射剂量是ORNJ发生发展的重要因素之一，从临床及动物实验结果得出60Gy是形成ORNJ的临界剂量，大于60Gy发生放射性颌骨坏死的可能性较大。目前，大多数研究均采用根据线性——二次模式总效应方程换算的单次高剂量放射建立下颌骨ORNJ的动物模型，但单次高剂量照射与临床实际放疗方案有所差距。此外有学者采用多次分割放疗模式建立ORNJ模型，尽可能模拟临床情况，但是需要多次连续对实验动物进行麻醉，增加了实验动物死亡风险。近年来常用的ORNJ动物模型建模方案见表13-1。
大量研究表明，放疗后拔牙是ORNJ的关键危险因素，在ORNJ实验动物模型构建中，选择放疗后拔除放射侧颌骨的磨牙，有利于诱导动物发生ORNJ。下面以啮齿类动物大鼠和大型动物小型猪为例，详细介绍放射性颌骨坏死模型建立的技术和方法。
表13-1 放射性颌骨坏死动物模型建模方案
（三）大鼠放射性颌骨坏死模型建立的技术和方法
选择健康SD大鼠，无特定病原体动物（specefic pathogen free，SPF）级，体重208～320 g，雄性，鼠龄8周，屏障系统中，标准鼠饲料分笼饲养。随机抽取若干只大鼠，3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后行全身CT扫描，获得数据进行固定支架三维模型设计，根据设计数据3D打印固定支架（图13-1A）。
在大鼠清醒状态下，用固定支架固定大鼠，铅板覆盖遮挡，于大鼠一侧下颌骨暴露出约1.3cm×2.3cm照射野，采用电子直线加速器进行照射，每次剂量为7Gy，连续进行5次照射，每天1次（图13-1B）。根据二次模式总效应方程换算照射总剂量为70Gy。
图13-1 SD大鼠放疗处理方法
A.大鼠固定支架设计。B.使用电子直线加速器进行照射
照射结束后6周，大鼠麻醉满意后于手术放大镜下拔除照射侧磨牙，完成大鼠ORNJ建模。
（四）山羊放射性颌骨坏死模型建立的技术和方法
成年健康山羊，月龄12月左右，体质量10～12 kg，雌雄不限，无口颌疾病，标准青饲料喂养，圈养1周后开始实验。采用速眠新麻醉，按体质量0.1 mL/kg肌内注射。
动物麻醉后，首先采用模拟定位仪定位照射范围：前界臼齿前缘、后界下颌骨升支后缘、上界下颌骨牙槽嵴（包括牙冠）、下界为下颌骨下缘。定位后，采用直线加速器按照剂量（20Gy、25Gy）行照射，左侧为照射侧，右侧为对照侧，对照侧采用铅板保护。直线加速器，放射线为X线，能量6 Mv，输出量为282 rad/min。
照射结束后45天在照射侧行拔牙术：全麻后常规消毒铺巾，拔牙为左侧下颌第一及第二磨牙，拔牙后缝合拔牙区牙龈减少出血，局部纱布压迫止血30分钟，观察无出血后放回笼中苏醒。拔牙后3个月、6个月，典型的ORNJ临床症状出现，建模成功（图13-2）。
图13-2 山羊ONRJ的组织细胞学、颌骨代谢和影像学变化
A.照射后下颌骨解剖标本示死骨暴露。B.颌骨ECT扫描图像示照射区域颌骨的低代谢。C.骨组织病理学切片，HE染色（×200）示骨陷窝空虚、死骨形成、骨髓纤维化，Masson染色（×400）示胶原纤维形成。D.照射前后颌骨的X线显示小梁结构无明显破坏。E.照射前后颌骨的CT示下颌骨皮质连续性好，三维重建显示颌骨形态正常。F.照射前后下牙槽动脉DSA影像示照射前后下牙槽动脉血管显影均清晰连续，差异不大
（五）小型猪放射性颌骨坏死模型建立的技术和方法
选择健康实验用小型猪，体重25～35 kg，雄性，月龄8～10个月，单笼饲养，自由获取水和食物。实验前采用氯胺酮和速眠新Ⅱ麻醉，按0.1 mL/kg剂量，耳后肌内注射。
小型猪颌骨照射采用图像引导放疗技术。在接受照射前1周，进行头颅CT扫描，划定颌骨放疗区域的上界为下颌骨上缘，下界为下颌骨下缘，前界为右侧下颌第一恒磨牙前缘，后界为右侧下颌升支前后缘间的中线，采集并重建三维图像，设定精准的颌骨放疗区域，中心靶区放射剂量达到95%以上，临床靶区剂量为100%，最大程度降低区域周围正常组织的损伤。1周后，采用照射源为Elekata Synergy直线加速器，射线平均能量6 Mv，照射距离100cm，照射剂量为25Gy，完成小型猪颌骨区域照射（图13-3）。
小型猪颌骨照射后2个月，拔除右侧下颌第一恒磨牙。照射后3个月小型猪出现颌面部皮肤破溃，瘘管形成，CT可见颌骨骨密度减低，骨皮质破坏，骨松质变形增厚，小型猪ORNJ模型成功建立。
三、放射性颌骨坏死模型表现特点
放射性颌骨坏死动物模型表现特点通常以大体观察、影像学分析及组织病理学观察为评价指标。
（一）大体观察
图13-3 小型猪颌骨区域放疗设计及图像引导放疗
图13-4 放疗后SD大鼠照射区的大体表现
A～C.可见左侧下颌拔牙窝（箭头）。A.对照组完整黏膜覆盖。B.死骨暴露。C.死骨暴露伴化脓性感染。D.左侧髁突体积变小（箭头）。E.左侧下颌门齿生长障碍。F.左侧下颌门齿生长障碍，咬合错乱
照射后大鼠颌骨照射区的皮肤开始脱毛，口内对应黏膜出现溃疡，拔除照射区磨牙后出现拔牙创不愈合、死骨暴露、门齿生长障碍、开口受限、皮肤感染等症状（图13-4），说明放疗后拔牙导致骨坏死的危险性大。然而，也有研究表明，放疗后拔牙等创伤因素与ORNJ的发生无关，对犬的一侧下颌骨进行照射，于照射后1个月拔牙，发现有40%拔牙创可以正常愈合，而未愈合的拔牙创与ORNJ病灶之间多有明显的骨硬化反应带，牙齿龋坏、松动可见其周边根部的骨组织有ORNJ形成，其结论是拔牙与ORNJ的形成没有直接关系，牙齿脱落是颌骨ORNJ的结果，而不是诱因。小型猪颌面部照射结束后3～4周，首先出现照射野口内黏膜脱色，与照射野外的黏膜界限清晰，后出现黏膜的充血水肿和上皮脱落，常伴有溃疡。照射结束后2个月，照射野内皮肤发生脱屑和出现水疱，随后出现大面积溃疡，溃疡愈合后表面毛发脱落，形成瘢痕，照射区域内皮肤均发生不同程度的萎缩；拔牙后拔牙创不愈合，后出现颌面部皮肤严重破溃，瘘管形成，反复流脓，部分严重的小型猪在拔牙后1个月（照射结束后3个月）形成右侧颌面部洞穿性缺损，死骨外露，创面不愈合，张口严重受限（图13-5）。
（二）影像学表现
建模SD大鼠拔牙后6周，处死动物，摘除下颌骨，用4%多聚甲醛溶液固定7天后进行micro-CT扫描，后进行三维重建和骨组织显微形态分析。照射组大鼠门齿牙根坏死，皮质骨变薄；拔牙窝骨质缺失，出现病理性骨折（图13-6）。
图13-5 小型猪颌骨照射后肉眼观
A.照射后2个月溃疡愈合后表面无毛，遗留色素斑和瘢痕，照射区域内皮肤均发生不同程度的萎缩（↑）。B.照射后3个月，右侧颌面部皮肤溃疡不愈，瘘管形成（↑）。C.照射后3个月，右侧颌面部洞穿性缺损，死骨外露（↑）(https://www.daowen.com)
图13-6 SD大鼠照射后下颌骨micro-CT图像
与图A（对照组）相比，图B（放疗组）大鼠门齿牙根坏死（*），皮质骨变薄（箭头）；与图C（对照组）相比，图D（放疗组）大鼠拔牙窝骨质缺失，病理性骨折，牙根结构消失（*）
建模小型猪拔牙后3个月，照射区域下颌骨骨密度降低，在阴影区夹杂着点状或团块状密度增高的病理性骨沉积，骨质破坏区形态不规则；拔牙后7个月，部分模型甚至出现了病理性骨折。冠状CT结果显示照射侧下颌骨骨质密度明显减低，骨皮质破坏严重，骨松质变形增厚，骨髓腔与外界相通（图13-7）。
（三）组织学表现
建模大鼠照射侧磨牙区可见空白骨陷窝增多，骨髓腔炎细胞浸润、纤维组织增生，门齿牙根坏死萎缩和皮质骨变薄，拔牙窝与门齿牙根周围可见局部骨坏死、游离死骨片，骨髓腔纤维组织增生，部分可见门齿牙根结构消失，由大量纤维组织与少量游离死骨片替代，可见病理性骨折（图13-8）。
建模小型猪照射结束后3个月，照射区域未失活骨内，可见哈弗管管腔增大，骨陷窝数量减少，部分骨陷窝空虚，骨细胞消失，并可见微裂，成骨和破骨现象均不明显；死骨组织镜下表现为缺少细胞结构的紊乱的一团组织，板层骨结构模糊或断裂（图13-9）。
四、动物模型在发病机制及治疗研究中应用
关于ORNJ的发病机制，国内外学者进行了深入的研究。从血管栓塞学说、“低氧、低细胞、低血管”的“三低”学说到骨细胞的直接损伤学说、萎缩纤维化学说等，为临床预防和治疗ORNJ带来了新的选择。由于多数关于体内研究所用的动物模型均为啮齿类，研究较为局限，对于ORNJ的发病机制，目前仍没有统一的认识。小型猪颌面部体积、解剖及生理特点与人类相似，是公认较合适口腔颌面部疾病研究的大型实验动物模型。
通过对小型猪颌骨放射后病理早期观察其时序性变化，发现照射后的早期有明显骨修复改建，表现为破骨功能活跃，5～7天达到峰值；随着成骨细胞活跃，9～11天出现成骨现象；但在放射后15天，出现血管闭塞，骨改建停止；之后胶原纤维大量降解。这些现象表明观察放疗后早期颌骨内血流及内皮细胞的相关情况具有重大研究意义。
图13-7 小型猪颌骨区照射后影像学表现
A.照射前。B.照射后2个月，拔牙之前。C.拔牙后1个月，骨质密度不均，骨小梁模糊或消失，呈不规则斑点状破坏（↑），边缘模糊。D.拔牙后3个月，骨质密度更低，同时在阴影区背景内夹杂着团块或点状密度增高的病理性骨沉积（↑），骨质破坏区形态不规则。E.拔牙后7个月，出现了病理性骨折（↑）。F.未经照射的左下颌X线片显示骨质密度接近正常
随后对小型猪颌骨放射前及放射后4小时、24小时及4周内局部血流变化观察，发现放射后3天内，颌骨内血流显著增加，至放射后5天逐渐恢复，放射后7天血流恢复至放射前水平，后缓慢下降，放射后11天显著低于放射前水平，至放射后15天约降至放射前50%，达到最少，之后趋于平稳并显著低于放射前水平。同时，在对颌骨接受放射骨区微管密度及内皮细胞凋亡早期相关的酸性神经鞘磷脂酶（acid sphingomyelinase，ASMase）的观察发现，在放射后4～24小时，酸性神经鞘磷脂酶显著增高后下降，血液流率应激性地增高，3天后内皮细胞凋亡数量达顶峰，骨内微血管密度显著下降，但血液流率仍达到最高；7天后血液流率降至正常，11天后血液流率继续下降低于正常，微血管密度降低，内皮细胞数量减少，15天后，血液流率下降约50%、微血管密度及内皮细胞数量均降至最低点。传统的放射导致细胞凋亡的理论主要与DNA损伤致使细胞有丝分裂期的细胞死亡及P53引起的细胞凋亡相关，神经鞘磷脂通路是放射性细胞凋亡的一个重要途径，电离辐射可激活神经鞘磷脂酶（sphingomyelinase，SMase），使其通过释放到细胞外，水解细胞膜上的神经鞘磷脂（sphingomyelin，SM），产生神经酰胺（ceramide，CER）。CER被合成后，可作为第二信使通过线粒体系统启动细胞凋亡。由于内皮细胞中SMase的含量远高于其他细胞，因此SMase的活性可有力地反映内皮细胞的早期凋亡。在放射后4小时，颌骨内酸性和中性神经鞘磷脂酶的活性均有较高程度的增加，提示在放射后早期颌骨内细胞凋亡的相关代谢即已开始活跃起来。之后由于内皮细胞的减少，SMase逐渐下降。这些发现表明放射损伤局部的微血管致局部低血流及低氧状态是ORNJ发生的关键因素。
图13-8 SD大鼠放疗后照射区组织学表现
A.对照组。B.牙根结构破坏，血管减少，纤维组织增生，死骨形成（*）。C.进一步加重，至原牙根位置由纤维组织与少量游离死骨片占据（×40）。D，E.大鼠拔牙窝，与图D相比，图E无黏膜覆盖，可见死骨暴露（*），髓腔炎症反应，髓腔间隙纤维组织增生（箭头，×100）。F.牙根旁皮质骨，可见病理性骨折（箭头，×100）
图13-9 小型猪颌骨照射后组织学表现
A.正常骨组织结构。B.照射3个月照射区域“未失活骨”。C.照射区域死骨
早年有学者将临床下颌骨ORNJ分为三期。Ⅰ期：只有下颌骨的表浅损害，面部软组织疼痛、肿胀、充血，无瘘管形成或仅为拔牙创口不愈合，无脓性分泌物。X线片显示为骨质疏松，骨密度轻度减低，无死骨形成。Ⅱ期：除有Ⅰ期软组织的改变外，瘘管形成，下颌骨的损害加重。暴露的骨皮质和下面的一部分骨松质发生坏死，骨面粗糙，有脓性分泌物。X线片显示下颌骨骨质密度明显降低且密度不均匀，但无游离死骨。Ⅲ期：软组织大面积溃烂不愈，瘘管形成。下颌骨呈弥散性损害，骨质暴露面积较大，有较多脓性分泌物。X线片显示有较大范围骨质密度降低或有游离死骨或病理性骨折。以小型猪建立的ORNJ基本可与Ⅲ期相似。在最新的放射性颌骨坏死临床BS分类分期，小型猪ORNJ模型可表现为B2S1类和B2S2类。
在小型猪ORNJ模型上刮除死骨，用自体骨髓间充质干细胞植入具有很好的治愈效果，骨髓间充质干细胞植入有望成为临床治疗ORNJ有效的新方法。
综上所述，ORNJ实验动物模型种类多，建模主体思路相同，方案存有差异。可以根据不同的研究目的，结合不同阶段病理过程及临床特点来选择合适的动物模型。理想的ORNJ动物模型，为该疾病的研究提供了良好的实验载体，为更深入地认识ORNJ的发生发展提供理论基础，为后期该疾病的诊断与治疗提供潜在的临床转化平台。因此，在成功建模的基础上进一步探究ORNJ的发病机制，寻找切实可行的防治模式仍是今后努力的方向。
（王松灵 朱钊）
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