第9章　血清miRNA作为精神分裂症诊断标志物的鉴定

目前，精神分裂症的诊断基于临床症状和体征，尚无可用的实验室检测指标。为了更好地探究miRNA对精神分裂症的诊断价值，我们选择了14种候选miRNA，通过qRT-PCR方法，检查了其在40位精神分裂症患者和40位健康对照者血清中的表达。最终鉴定出3个异常表达的miRNA，即miR-34a-5p，miR-432-5p，miR-449a。随后，采用二元回归分析对3个异常表达的miRNA的组合进行建模。ROC分析显示，miR-432-5p＋miR-449a组合的AUC为0.841（95%CI：0.791～0.887），灵敏度为90%，特异度为80%；miR-34a-5p＋miR-432-5p＋miR-449a组合的AUC为0.843（95%CI：0.791～0.887），灵敏度为90%，特异度为77.5%。结果表明，miR-432-5p＋miR-449a和miR-34a-5p＋miR-432-5p＋miR-449a的组合模型具有更好的预测性能。该研究证实了两种miRNA的组合有可能被用作精神分裂症诊断的生物标志物，有助于克服当前精神分裂症诊断所面临的困境。

9.1　背景

精神分裂症是一种常见的精神疾病，终生发病率接近1%［1］。当前，精神分裂症的诊断是基于症状和体征异常的临床评估，尚无可协助精神分裂症的临床诊断的生理和生化指标。miRNA是一类短内源性非编码RNA，它参与编码蛋白质的基因的转录后调控［2，3］。研究发现，miRNA参与调节许多重要的生物学功能和过程［4，5］，几乎参与了所有生命过程［6］。miRNA表达的改变反映了神经精神疾病在遗传和生物学方面的变化［7］，包括精神分裂症［8－10］。

尽管精神分裂症的病因尚不清楚，但在精神分裂症患者的脑组织［11－13］、全血［14］、血清［15］、血浆［16，17］和外周血单核细胞（PBMC）［18，19］中检测到异常表达的miRNA。这些miRNA可作为精神分裂症诊断的生物标记物。实际上，来自血液的疾病诊断与治疗的生物标志物已越来越多地引起了研究者的关注［19－21］。Lai等［19］在精神分裂症患者的PBMC中发现了7种异常表达的miRNA，即miR-34a，miR-564，miR-449a，miR-548d，miR-432，miR-652，miR-572。Shi等（2012）证实了5种miRNA，即miR-181b，miR-1308，miR-219-2-3p，miRNA-195，let-7g在精神分裂症患者血清中异常表达［15］。Sun等人［17］分析了精神分裂症患者血浆和PBMC中的9种精神分裂症相关miRNA，证实了血浆miRNA30e可作为精神分裂症诊断的生物标志物。W ei等证实，miR-193a-3p和miR-130b可用作精神分裂症诊断的生物标志物［22］。Sun等人［16］确定了血浆中的miR-30e，miR-34a，miR-346，miR-181b，miR-7有作为精神分裂症的非侵入性诊断标记的潜力。随着miR-34a，miR-564，miR-449a，miR-548d，miR-432，miR-652，miR-5727被确认为精神分裂症的潜在生物标志物，Lai等人再次证实7种miRNA在住院两个月以上且症状缓解的精神分裂症患者外周血中的表达没有发生变化，因此它们作为精神分裂症的诊断生物标志物是稳定的［23］。Liu等人证实，EGR1-miR-30a-5p-NEUROD1轴可用作急性精神病状态下精神分裂症的诊断标志物［24］。Ma等证实精神分裂症患者外周血中miR-22-3p，miR-137，miR-92a-3p的 表 达 异 常，miR-22-3p，miR-137，miR-92a-3p的组合可作为精神分裂症的诊断生物标志物［25］。

根据上述文献，我们选择了14个候选miRNA，这些miRNA被证实可作为精神分裂症患者的全血、血浆、PBMC或血清中的生物标志物。14个候选miRNA是miR-30e-5p，miR-130b-3p，miR-652-5p，miR-193a-3p，miR-181b-5p，miR-34a-5p，miR-346，miR-572，miR-7-5p，miR-449a，miR-564，miR-432-5p，miR-548d-3p，miR-30a-5p。我们使用qRT-PCR检查了14个miRNA在40例精神分裂症患者和40例健康对照者血清中的表达，并进一步探讨了其对精神分裂症的诊断价值。

9.2　材料与方法

9.2.1　研究对象

本研究中所有被诊断为精神分裂症的患者至少由两名经验丰富的精神科医生根据《精神障碍诊断和统计手册》第四版（DSM-Ⅳ）和《国际疾病分类10》（ICD10）中的标准进行诊断。所有患者均接受抗精神病药物（包括阿立哌唑、利培酮、奥氮平和氯氮平）的治疗。对照组是从志愿者中招募的，且排除了献血者和任何患有或曾患有精神疾病以及其亲属患有或曾患有精神疾病的个人。在进行这项研究之前，我们获得了所有研究者的书面知情同意书，且该研究得到中国通辽市精神卫生中心伦理委员会的批准。

9.2.2　血液的采集

清晨空腹采取精神分裂患者和健康对照组外周静脉血5 mL，置于无菌无酶的加有柠檬酸钠抗凝剂的采血管中。采集新鲜血液，在4℃静置30 min后，吸出上清液，10 000 g离心5 min后，所得到的上清即为血清。将分离得到的血清和血浆分别置于－80℃冰箱保存待用。

9.2.3　miRNA的选择

我们选择了14个候选miRNA，即miR-30e-5p，miR-130b-3p，miR-652-5p，miR-193a-3p，miR-181b-5p，miR-34a-5p，miR-346，miR-572，miR-7-5p，miR-449a，miR-564，miR-432-5p，miR-548d-3p，miR-30a-5p。这些来自精神分裂患者全血、血浆、PBMC或血清中异常表达的miRNA被证实可作为精神分裂症诊断的生物标志物。

9.2.4　总RNA抽提和qRT-PCR定量分析

使用m iRcute血 清／血 浆miRNA分 离 试 剂 盒（TIANGEN BIOTECH，中国）抽提血清总RNA，使用NanoD rop 2000（Thermo，美国）进行定量。利用m iRcute PlusmiRNA First-Strand cDNA试剂盒（天根生物科技有限公司，中国）对每个样品的总RNA（1μg）进行反转录。使用2×SYBR qPCR Master Mix（庄盟国际生物技术有限公司，中国）进行实时定量PCR，对miRNA表达进行相对定量。为了使miRNA表达均一化，研究选择了U6作为内参基因。每个样品检测三次，然后使用2－ΔΔCt方法分析表达数据［26］。有关miRNA和U6的引物信息，见表9-1。

9.2.5　数据分析

使用SPSS软件版本20.0（美国纽约）、GraphPad Prism版本7.0（美国加利福尼亚）和MedCalc统计软件版本18.2.1（比利时奥斯坦德；http／／www.medcalc.org）分析数据，使用Mann-W hitney U检验分析数据（以平均值±SEM表示）。统计学上的显著性水平设为P值＜0.05。使用二元回归分析，将3个异常表达的miRNA组合进行建模。利用ROC曲线评估了三种miRNA及其组合的诊断性能。

9.3　结果

患者和对照组的基本人口统计学特征见表9-2。两组之间在年龄和性别上均未发现显著差异（所有P＞0.05）。利用qRT-PCR方法来比较患者和对照之间14个候选miRNA的表达差异。在精神分裂症患者中miR-34a-5p，miR-432-5p，miR-449a的表达与健康对照者相比存在显著差异，3个异常表达的miRNA的相对表达水平见图9-1。

为了进一步评估3个差异表达的miRNA的诊断价值，构建了ROC曲线，如图9-2和表9-3所示。其中，miR-432a-5p具有最佳的诊断性能，其AUC为0.764（95%CI：0.706～0.817），敏感度为62.5%，特异度为82.5%，Youden指数为0.45。

ROC曲线表明，miR-34a-5p＋miR-432-5p，miR-432-5p＋miR-449a，miR-34a-5p＋miR-432-5p＋miR-449a的组合具有更好的诊断性能，AUC分别为0.807（95%CI：0.752～0.855）、0.841（95%CI：0.789～0.885）和0.843（95%CI：0.791～0.887），见图9-3。miR-34a-5p＋miR-432-5p的组合具有97.5%的敏感度、55%的特异度和0.525的Youden指数；miR-432-5p＋miR-449a的组合具有90%的敏感度、80%的特异度和0.7的Youden指数。miR-34a-5p＋miR-432-5p＋miR-449a的组合具有90%的敏感性、77.5%的特异性和0.675的Youden指数，见表9-3。综合考虑AUC、敏感性、特异性和Yoden指数等指标，miR-432-5p＋miR-449a的组合和miR-34a-5p＋miR-432-5p＋miR-449a的组合表现出更好的诊断性能。

9.4　讨论

本研究选取了14个候选miRNA，检查了它们在精神分裂症患者和健康对照血清中的表达，并探讨其对精神分裂症诊断的价值。qRT-PCR结果显示，精神分裂症患者血清中miR-34a-5p，miR-432-5p，miR-449a的表达与健康对照相比存在显著差异。miR-432-5p＋miR-449a和miR-34a-5p＋m iR432-5 p＋miR-449a组合的AUC与任何单个miRNA相比都大，且这两种组合有可能作为精神分裂症诊断的生物标志物。

该研究证实，miR-34a，miR-432，miR-449a在精神分裂症患者的血清中表达显著改变，这表明它们可能在精神分裂症的发生中发挥作用。miR-34a与神经发生和神经分化有关［27，28］，且已在精神病患者的脑组织中发现了miR-34a表达发生改变［29，30］。Schipper等发现，阿尔茨海默病患者（AD）的PBMC中miR-34a的表达明显上调［31］。研究证实，自闭症患者的死后小脑皮层中miR-432的表达水平发生了改变［32］。有研究发现，AD患者大脑的脑脊液中miR-449表达水平失调［33］。W u等人证实miR-449和miR-34b／c在大脑正常发育中非常重要［34］。Hauberg等人使用精神分裂症的全基因组关联分析（GWAS）结果，预测miRNA的靶基因并进行回归和富集分析，以探讨miRNA对精神分裂症风险基因的调控，他们在富集分析中列出了10个保守的miRNA，包括miR-34ac-5p和miR-449a，并指出这些miRNA在精神分裂症发生中发挥重要的作用［35］。另外，他们还使用TargetScan的预测发现了hsa-miR-34a的几个靶基因，如GREM 2，TANC2，CAMSAP1，RGMB，CALN1，RTN4RL1，FKBP1B与神经元的发育和功能有关［23］。本研究表明，精神分裂症患者血清中的miR-34a-5p，miR-432-5p，miR-449a表达异常。在此之前，Sun等人证实了精神分裂症患者PBMC中miR-34a的异常表达［17］。Sun等人再次发现miR-34a和miR-432的表达水平在精神分裂症患者血浆存在表达差异［16］。Yu等人证实，与健康对照组相比，精神分裂症患者的PBMC中miR-432的表达水平显著下调［21］。Lai等人证实，住院两个月以上且症状缓解的患者的PBMC中，miR-34a，miR-432，miR-449a表达水平并未改变［23］。他们认为住院和缓解症状不会影响循环miRNA的表达，因此它们也成为外周血中足够稳定且可检测的生物标志物［23］。此外，Lai等人调查了从初生儿至成年期血液中miRNA的表达变化，发现miR-34a，miR-432，miR-449a从婴儿期到成年期均表达一致［36］。(https://www.daowen.com)

该研究的局限性在于研究的样本量较小及缺乏区分精神分裂症患者的症状。此外，本研究中所有入选患者均接受抗精神病药物治疗，我们不能排除在治疗前后这些miRNA表达变化的可能性。

总之，我们在80名受试者血清中筛查了14种候选miRNA的表达，发现miR-34a-5p，miR-432-5p和miR-449a在精神分裂症患者血清中存在异常表达。AUC值表明，miR-432-5p＋miR-449a和所有三个miRNA的组合可用作精神分裂症的生物标志物。因此，两种新型精神分裂症诊断模型有可能作为精神分裂症诊断的生物标志物，也将有助于克服当前精神分裂症诊断所面临的困境。

本章参考文献

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