本章参考文献
第十章 切割基因组的“手术刀”
基因组编辑技术可以说是当前最为热门的研究领域之一。2011年，基因组编辑当选为年度实验方法；2015年，《科学》杂志评价CRISPR／Cas9基因编辑系统为年度重要突破之一。本章就来介绍一下基因组编辑技术的发展和应用。
一、引言
基因组编辑技术是利用工程化的核酸酶对基因组进行切割，并借助细胞自身的修复能力产生基因组编辑的技术。提到核酸酶，最为人熟知的是来自细菌的可以切割核苷酸的酶。根据作用底物的不同，核酸酶可以分为RNA类核酸酶和DNA类核酸酶。根据切割方式的不同，核酸酶也可以分为内切酶和外切酶。其中限制性内切酶是工程化的核酸酶，可以用来识别特异性的回环序列，主要用于分子克隆。
用于编辑基因组的核酸酶，属于工程化核酸酶的一种。它们也来源于细菌，但是经过一定的修饰和改造，可以达到靶向切割DNA序列的效果，所以是一种对基因组进行精确编辑的核酸酶。目前用于基因组编辑的核酸酶主要包括巨核酶（Meganucleases）、锌指核酸酶（ZFN）、转录激活效应核酸酶（TALEN）和CRISPR／Cas9系统。这一类核酸酶主要的作用机制是，工程化的酶特异性识别基因组特定的序列并与之结合，然后核酸酶对相应位置进行酶切割，产生双链DNA缺口（DSBs），在细胞自身的修复体系下，缺口会以非同源末端结合（NHEJs）或者同源重组（HR）的方式进行修复。会有一定概率造成原基因的突变（主要包括缺失突变、移码突变、终止突变等），非同源末端结合的修复会造成基因表达的缺失。另一方面当同时加入与编辑位点同源的供体模板时，可以引起同源重组突变，这种突变可以实现一段序列的定点插入。在修复的过程中可以引入随机的或者可诱导的定点突变。
二、巨核酶介导的基因组编辑技术
巨核酶也叫作归巢核酸内切酶，是可以识别12～40个核苷酸的一类核酸内切酶。每一种巨核酶对于底物都具有极高的特异性，同时相较于其他核酸酶，巨核酶的毒性较小。所以早在2003年巨核酶就被用于基因组编辑。巨核酶在发挥作用的时候，是通过左右两个单体分别识别DNA序列，然后通过核酸酶酶切活性剪切基因组序列的。巨核酶单体在结构上并不明显区分为DNA结合域结构域和核酸酶酶切结构域。其中来自LAGLIDADG家族的巨核酶是目前研究和应用最多的一类巨核酶。
由于巨核酶对底物的高度特异性识别，所以在选用巨核酶切割基因组的时候，并不能对基因所有位置进行切割。科学家在扩展巨核酶识别位点方面主要通过两种方法来提高巨核酶的应用范围。一是通过工程化的方法对巨核酶进行改造，但是正如之前提到的，巨核酶本身没有明显的DNA结合结构域，所以这对蛋白改造也造成了一些困难。二是通过蛋白结合的方法，将具有可调节识别能力的蛋白序列（例如TAL结构域）与巨核酶结合在一起表达。这样既能达到识别的可选择性，也可以利用巨核酶高效的酶切效率。此外，还可以将以上两种方法结合在一起，产生特异性识别的巨核酶。来自法国的研究小组结合以上两种思路对I-CreI进行改造，获得了超过2000个由I-CreI改造而来的巨核酶。而Precision Biosciences生物技术公司也可以为客户提供识别特定序列的巨核酶。
除了识别DNA序列范围有限之外，另一个影响巨核酶应用的方面是巨核酶的脱靶效应。虽然巨核酶本身的特性决定了它的高度特异性，但是这种对DNA序列的特异性识别是有一定误差的。也就是说，在巨核酶识别的序列中，如果有1～2个错配，巨核酶依旧可以对其进行酶切，只是切割效率相对于完美匹配稍弱一些。所以在选用巨核酶的时候，要同时考虑特异性和脱靶效应。目前巨核酶主要用于农作物的基因组修饰，主要包括玉米、大豆、水稻、棉花等。
三、锌指核酸酶介导的基因组编辑技术
锌指核酸酶介导的基因组编辑技术，主要是由工程化的锌指核酸酶来实现对于靶序列的切割。该类核酸酶由锌指蛋白和FokI剪切酶组成，在实现基因组编辑的时候，需要左右两个核酸酶共同完成，通常可以识别18个核苷酸序列。锌指蛋白负责对序列的识别。通常一个ZFN由3～4个锌指结构域组成，每个结构域包含大约30个氨基酸，可以识别3个核苷酸。ZFN核酸编辑技术最早在2005年开始被大规模用于基因组编辑技术。
相对于巨核酶的识别局限性，ZFN具有一定的可调控性，可以较广泛地识别基因组DNA序列。这种可调控性，主要通过将识别不同核苷酸的锌指结构域组合在一起来实现。ZFN的不同组合可以用于基因组编辑，接下来将举例说明ZFN的临床相关应用。首先是针对HIV患者进行CCR5缺失突变的基因编辑。HIV病毒主要侵入CD4T细胞，在病毒入侵的过程中，有来自T细胞本身的受体负责与病毒的相关膜蛋白结合，协助HIV病毒进入宿主细胞。CCR5就是其中的一种。人们发现CCR5对HIV病毒入侵具有极其重要的功能，主要是因为一起偶然事件。德国一位患有白血病并携带HIV病毒的患者在经过骨髓移植后，白血病改善，而且体内的HIV病毒也消失。进一步对患者进行分析后，发现他移植的骨髓是携带CCR5-Δ32突变的。而CCR5-Δ32使HIV病毒不能够继续侵入宿主，所以该患者可以保持在未服用其他抗病毒治疗的情况下，两年内未检测到HIV病毒。这一发现证实了CCR5在介导HIV病毒侵入时的重要作用，所以科学家致力于利用基因组编辑技术，对于HIV患者的CD4T细胞进行体外CCR5基因缺失编辑，之后将编辑正确的T细胞再输回患者体内，实现对于HIV的治疗。2014年，针对12名HIV患者的临床研究结果发表在《新英格兰医学杂志》上，结果表明将ZFN编辑过的T细胞再次输回患者体内之后，在治疗期间，患者HIV病毒明显降低。这一技术最终用于临床还需要很多努力，但是ZFN介导的基因组编辑技术确实为疾病治疗提供了新的思路。目前ZFN的临床应用主要用于单一基因造成的疾病，例如针对B型血友病患者凝血因子9缺失的情况，可以用ZFN特异性在基因组某个位置引入该基因，从而治愈疾病。
同时，ZFN的使用也有其局限性。每个锌指结构域负责识别三个核苷酸，所以说即使锌指结构域是可以随机组合的，也并不能够实现对于基因组任意位置的识别和剪切。这一方面同样可以通过基因工程的方法获得更多的锌指结构域来解决，另一方面，ZFN在基因编辑的时候也会出现脱靶效应，也就是说ZFN蛋白对于错误匹配也有一定的容忍度，所以会造成对非靶向位置的剪切。针对这一情况，目前在生物技术上能够做出的技术改进主要包括以下几个方面：一是改变以DNA形式将ZFN转染到细胞的方式，而以蛋白形式直接向细胞导入ZFN。DNA在转染进入细胞后，有一定概率会随机插入宿主基因组，而ZFN的长期表达是造成它脱靶效应的一部分原因。ZFN蛋白本身具有穿透细胞进入细胞的特性，以蛋白形式进入细胞的ZFN在发挥4～6小时的剪切功能之后会被细胞降解掉，所以会减少因ZFN滞留而导致的脱靶效应。二是工程化改造ZFN蛋白的酶切结构域，主要是将FokI酶改造成只能剪切DNA单链的Nickase，这样可以在限制基因组编辑活性的同时减少脱靶效应。
四、转录激活效应核酸酶介导的基因组编辑技术
继ZFN基因组编辑技术之后，2009年，科学家发现细菌中还存在一种效应分子可以特异性识别DNA序列。当在其中加入FokI酶酶切结构域之后，该核酸酶就可以实现对基因组的靶向编辑，这就是转录激活效应核酸酶介导的基因组编辑技术。这项技术一出现，便受到认可，并在几个月内就有公司推出了针对基因组任一基因的TALEN编辑定制。那么？相较于ZFN编辑技术，TALEN到底有什么优势呢？TALEN在发挥功能时，也需要由左右两个蛋白共同完成，与ZFN不同的是，TALEN的识别是由多个重复可变序列（RVDs）来完成的，每个RVD由34个氨基酸组成，可以识别1个核苷酸序列，多个RVDs组合在一起就能识别特定的基因组序列。由此不难看出，TALEN的特异性和可调控性更好，其通过对每个核苷酸的特异性识别来完成对于整段序列的识别。这种自行组合的基因组编辑方式，使整个基因组的编辑成为可能。此外，TALEN比ZFN蛋白对细胞的毒性更少。
然而，TALEN的应用并没有想象中那么广泛，这当然与后期CRISPR／Cas9基因编辑的大规模使用相关。TALEN本身在应用时有几个问题：一方面，虽然可以通过自由组合来实现对于任意序列的靶向，但是自由组合的代价是比较昂贵的，针对每个序列都需要重新合成、纯化具有活性的TALEN蛋白，费用相对较高。另一方面，TALEN蛋白普遍偏大，大小超出了慢病毒以及腺相关病毒的包装能力，这对于它后期应用于临床是一种限制。
五、CRISPR／Cas9介导的基因组编辑系统
最后一类核酸酶介导的基因组编辑系统就是由CRISPR／Cas9介导的基因编辑系统。这也是目前使用最为普遍、受到研究者广泛关注的基因组编辑系统。CRISPR／Cas9最开始是在细菌中被发现的，属于细菌用来抵抗外来病毒和质粒入侵的一种自我防御方式。外源病毒或者质粒的一部分DNA序列会被整合到CRISPR的位置，然后被转录为CRISPR RNA（crRNA），这个RNA可以引导Cas9蛋白结合到外源DNA上，并将外源DNA剪切、降解。进一步的研究发现，Cas9蛋白在执行剪切功能的时候，主要识别的是一段被称为PAM的序列。2013年，CRISPR／Cas9基因组编辑系统被优化并被广泛应用。优化的CRISPR／Cas9主要包括一段引导RNA（guide RNA）和Cas9蛋白。这两个成分可以由一个质粒同时表达出来，也可以由两个质粒分别表达出来，目前CRISPR／Cas9载体系统已相对完善。guide RNA主要起到序列识别功能，它是一段与靶位点互补结合的序列，在选择靶点的时候要考虑发生剪切的位点是在PAM位置。Cas9主要实现对于序列的切割。由于guide RNA的选取相对灵活，所以CRISPR／Cas9系统的编辑范围也是比较广泛的。同时，不同DNA序列的编辑只需要改变guide RNA的序列即可实现，所以在价格上也比其他三种核酸酶编辑技术便宜。
目前，CRISPR／Cas9基因组编辑系统在细胞水平和动物水平的应用都相对完善，但是该系统也有一些需要改进的地方，其中最为主要的还是基因组编辑的脱靶效应。目前CRISPR／Cas9的脱靶效应也是影响其临床应用的主要原因。可以将Cas9剪切酶变成只能剪切单链的nickase，也可以以蛋白质形式向细胞导入Cas9蛋白，减少该系统在细胞中的滞留时间。与之相应发展起来的是蛋白的核转染技术，目前从仪器到试剂盒都是比较成熟的。此外，还有研究表明，减少Cas9的用量可以部分降低脱靶效应。科学家也试图通过条件性激活的方法，调控Cas9的剪切活性。
六、基因组编辑技术的应用
1.对于细胞和生物体的基因组编辑
从以上对于核酸酶介导的基因组编辑技术介绍，可以看出利用核酸酶的靶向编辑可以实现对于基因的各种形式的突变，如基因缺失、基因插入、基因倒置、基因校正，甚至染色体易位。而这些基因操作是在细胞水平检测基因功能所必需的。在研究某个基因的相关功能时，首先会考虑在细胞水平将其敲除或者过表达，然后检测细胞功能是否发生变化。这不仅对于单一基因功能的确定是有意义的，利用核酸酶介导的基因组编辑还可以实现对于所有基因的功能筛选。以CRISPR／Cas9为例，构建针对所有基因的特异性guide RNA文库，即可实现对每个基因的靶向敲除，再加上相关表型的测定，将筛选出一批功能相关的基因。这已经成为代替shRNA文库的功能筛选方法。
从细胞水平的基因组编辑还可以延伸到对整个生物体的基因组编辑。首先想到的是转基因生物的产生。如果在受精卵阶段对基因组进行编辑，这种基因组的改变就可以遗传到整个生物的每个细胞。CRISPR／Cas9已成功地被用来构建转基因斑马鱼、小鼠、大鼠、猴子以及部分家畜。而且使用CRISPR／Cas9构建转基因动物，实验操作较传统方法简单一些，实验周期也相对较短。而另一种动物水平的基因组编辑是指对动物的某一个器官或组织进行的编辑。也可以直接在动物组织或者器官水平进行核酸酶的转染，以实现对组织器官的基因组编辑。目前小鼠核转染仪器也已经用于实验室研究。裘馨氏肌肉萎缩症（Duchenne Muscular Dystrophy）是一种遗传性的肌肉萎缩，患者体内抗肌萎缩蛋白（Dystrophin）发生突变，突变小鼠四肢肌肉呈现萎缩状态，并最终导致小鼠死亡。通过电转染的方法将校正突变基因的核酸酶导入小鼠肌肉组织后，可以改善小鼠的萎缩症状。
靶向基因组编辑技术在植物工程学中也得到了广泛的应用，例如研究人员利用CRISPR／Cas9技术向小麦基因组插入抗白粉菌的基因，可以大大提高后代小麦的抗病性。另外，基因组编辑技术还试图沉默致病与病虫感染相关的基因，以确保作物的健康生长。在合成生物学中，靶向基因组编辑技术也得到了重视。常见的放线菌是工业用来生产次级代谢产物的主要来源。通常放线菌对于传统的基因改造是具有抵抗性的，研究人员发现CRISPR／Cas9技术可以用来改造放线菌的基因组，并有助于提高产量。此外，基因组编辑技术还被用来提高酵母代谢产物的效率。
2.治疗性的基因组编辑
最终的基础研究都是为了临床的应用，基因组编辑技术也不例外，科学家试图将在体外进行的实验最终应用于临床问题的解决。除了对CD4T细胞进行体外编辑之外，利用ZFN对造血前体细胞的CCR5进行基因缺失突变也可以实现控制HIV病毒的效果。在2014年的临床一期实验中，改造的CD4T细胞再次输回患者体内后被证明是安全有效的。除了部分已经进入临床试验的工作之外，小鼠模型中，也有很多验证CRISPR／Cas9基因组编辑的工作正在进行。例如一种被称为“先天性酪氨酸血症”的隐性遗传疾病，是由一种水解酶基因突变缺失造成的酪氨酸异常代谢疾病。在小鼠疾病模型中，研究人员向小鼠注射校正基因突变的CRISPR／Cas9质粒以及DNA模板，可以治愈小鼠的病症。
七、基因组编辑相关的社会伦理问题
针对基因组编辑的伦理争议并不是因为靶向性核酸酶编辑才产生的。起先，科学家试图在生殖细胞上进行基因组改造，就引起了很大争议，包括对胚胎干细胞的基因改造在内的诸多方面都引起了社会伦理争议。以CRISPR／Cas9为主的核酸酶介导的基因组编辑又一次引起伦理争议，是因为相较于传统基因操作，靶向核酸酶修改基因组更为容易和便捷。人们恐慌的是任何实验室都具备修改生物体基因组的能力，如果不加以管理和控制，可能会引发不好的后果。截至2014年，已有超过40个国家禁止对生殖细胞基因组进行编辑。2015年，美国、英国和中国共同发起并制定了对基因组编辑的行为规范。
核酸酶介导的基因组编辑到底还存在哪些问题，特别是不安全因素呢？首先，是“脱靶效应”的问题。这种对于非靶点的剪切可能会造成不可预测的结果。尤其是如果操作对象是生殖细胞的话，后代不可控的基因组变化会带来安全隐患。根据2015年国际人类基因编辑峰会的提议，目前即使认为生殖细胞基因组编辑是安全的也不允许将其用于临床。从另一方面讲，用于治疗遗传疾病的生殖细胞基因组编辑又是患者所需要的。所以科学家提出，在一定情况下，应该考虑将基因组编辑技术应用于遗传疾病的治疗。但是真正要用于治疗和产生无疾病后代的时候，人们首先担心的还是核酸酶编辑引起的脱靶效应，不确定患者的后代能否得到满意的治疗效果。其次，对于基因编辑产生的后代是否会被社会歧视也是伦理学家所顾虑的。在科幻影视中，出现过关于克隆人的题材。那么与克隆人类似的经过基因组编辑的人是否也应获得相应的权利？人们是否会因为他们遗传背景的不同而歧视他们呢？(https://www.daowen.com)
小 结
靶向核酸酶介导的基因组编辑技术，不仅方便了实验室研究，更为重要的是可以用于解决临床问题。本章主要介绍了当下使用较为普遍的四种核酸酶基因编辑技术的应用和发展。当然，针对该技术在临床上的应用还存在社会伦理的争议。但是在科学研究上，从来没有一件事情是那么容易成功的。科学家应该做的是遵守伦理，在出现问题的时候，竭尽全力解决问题。相信通过全人类的共同努力，我们会享受到更多的科研硕果。
思考与练习
1.简述四种常见的核酸酶基因组编辑技术。
2.TALEN核酸酶如何实现对任意DNA序列的识别与剪切？
3.简述CRISPR／Cas9编辑系统如何实现对DNA的识别与剪切。
4.核酸酶基因组编辑技术有哪些应用及伦理争议？
本章参考文献
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