2.方法

（1）丙酮粉的制备。按照Hageman和Arnon的方法（1955），10克鲜荚剪碎后加15 ml EDTA（0.03 mol/L）和磷酸钾（0.1 mol/L）缓冲液（pH 8.2）研磨成细末。缓缓加入100 ml用干冰冷却到-15℃至-20℃的冷丙酮，用布氏漏斗迅速抽气过滤，再用40 ml冷丙酮洗三次，抽干。丙酮粉在室内放置1小时左右，至无丙酮味，然后转移到盛P2 O5的真空干燥器中干燥。全部操作在0—5℃进行。干燥后的丙酮粉置于小广口瓶中在-15℃下保存。一般保存时间不超过一个月。

（2）酶液的提取。按照10克鲜组织加25 ml EDTA（0.001 5 mol/L）和磷酸钾（0.01 mol/L）缓冲液（pH 7.2）的比例，向丙酮粉中加缓冲液研磨提取。用四层纱布过滤，弃去残渣。滤液用10 000×g冷冻离心5～10分钟，测定G-6-P脱氢酶和6-PG脱氢酶。其余酶测定一般取用5 000转/分，离心20分钟左右的上清液。离心液用滤纸或玻璃毛过滤，几小时内进行测定（酶液未经透析，含有一定量的内源底物）。

（3）酶活力测定。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶根据还原型NADP在340 μm波长处的吸收峰，用Beckman DU型或日立分光光度计测定。转化R-5-P的酶系的测定是以酶液和R-5-P保温，一定时间后，测定R-5-P的减少。己糖激酶测定是以葡萄糖和ATP与酶液保温，利用内源G-6-P脱氢酶，用日立分光光度计测定340 μm处的NADP的还原作用来测定形成的G-6-P量。磷酸己糖异构酶按Slein（1955）方法，以G-6-P为底物测定形成的F-6-P，F-6-P按Roe（1934）法测定。磷酸己糖激酶活力是以F-6-P和ATP作用后生成的FDP表示。醛缩酶按Sibley（1949）法略作修改，以巴比妥酸为缓冲液，亚硫酸氢钠为固定剂，测定FDP分解产物（磷酸丙糖）。3-磷酸甘油醛脱氢酶按Black等（1962）方法，根据NADH在340 μm的光吸收用日立分光光度计测定。3-磷酸甘油酸激酶采用Axelrod（1953）的方法，以3-PGA为底物，酶反应后产生的1，3-DPGA变成羟肟酸后测定。从3-PGA至丙酮酸形成的酶系是以3-PGA为底物，加上各种辅因子，按Kachmar（1953）法测定形成的丙酮酸。(https://www.daowen.com)

（4）糖磷酯纸谱分离（Bandurski 1951）。采用杭州1号滤纸（20 cm×30 cm），先用酸相（甲醇∶甲酸∶水=80∶15∶5）洗一次。样品于碱相中（甲醇∶NH3∶水=60∶10∶30）下行36小时（2℃）。显色剂改用钼酸铵（4%钼酸铵∶60%过氯酸∶IN HC1∶水=25∶5∶10∶60）和H2S显色。凡有糖磷酯处变成蓝色。

（5）产物分析。己糖用蒽酮法或硫酸-半胱氨酸法（Dishe等，1949）测定。果糖用Roe法测定。戊糖和景天庚糖用甲基间苯二酚法测定（Horecker等，1953），加热时间为40分钟。戊酮糖按Dishe等（1951）的咔唑反应测定。丙糖用二硝基苯肼法测定（Sibley，1949）。G-6-P的测定是反应液中加入NADP和纯化的酵母G-6-P脱氢酶，测定340 μm处的光吸收。FDP是借结晶醛缩酶的作用，测定形成的磷酸丙糖量（反应条件同醛缩酶一样）。