油菜内源抑制剂对代谢途径的调节作用

3.油菜内源抑制剂对代谢途径的调节作用

1）抑制剂的发现

在测定油菜花蕾G-6-P脱氢酶和6-PG脱氢酶时，发现活力都很低。这到底是酶蛋白本身缺少，还是酶蛋白受到某种因素的限制，以致不能表现活力。试验证实了后一种设想。

当花蕾酶液稀释后，酶活力即突然上升。如从1 ml酶液降为0.5 ml时，G-6-P脱氢酶活力增加5倍，6-PG脱氢酶活力增加4倍。因而可以设想，在油菜花蕾提取液中存在天然抑制剂，使G-6-P脱氢酶和6-PG脱氢酶处于不活跃状态。当酶液稀释后，抑制剂浓度冲淡，抑制作用解除，因而酶活力得以表现。

为了进一步证实抑制剂的存在，将花蕾丙酮粉提取液煮沸6分钟，蛋白沉淀弃去，上清液加到花蕾酶液中，结果大大地抑制了G-6-P和6-PG脱氢酶的活力。对于油菜老荚的酶活力也表现出同样强烈的抑制效应（80%～90%），而且随着抑制剂浓度的增加，抑制程度也加大（见图3）。

油菜花蕾抑制剂作用极为广泛。对于棉花苗根、大豆种子和酵母中纯化的G-6-P脱氢酶都有强烈的抑制作用。

2）抑制剂的作用性质

（1）与巯基的关系。花蕾抑制剂的抑制作用不能为半胱氨酸和谷胱甘肽所恢复（见表4），所以其作用点不是巯基。

（2）溶解度。将花蕾丙酮粉用不同溶剂提取，提取液减压浓缩，赶去溶剂。剩下残渣溶解于水，测定对脱氢酶的抑制效力。发现抑制剂极易溶于水，也能溶于热酒精、正丁醇和乙醚，但不溶于氯仿和苯（见表5）。

（3）稳定性。抑制剂对热稳定。酶液煮沸5分钟后，清液仍有抑制活力（见表6），但抑制剂对紫外线敏感，能为紫外线所破坏。

（4）分子大小。抑制剂对5 000毫升磷酸钾-EDTA缓冲液透析6小时后，测定其活力，如表6所示，保存了大部分活力。说明抑制剂可能主要是一些分子较大的化合物，但它不是蛋白质，因为煮沸去蛋白后，清液仍具有抑制作用。为了进一步证实抑制剂不是蛋白质，用100%饱和度（NH4）2SO4将酶蛋白全部沉淀下来，溶解后加到油菜荚酶液中，结果未表现出抑制活力（表6）。

（5）带电性质。抑制剂进行纸上电泳时，从阳极游向负极，故带阳电。移动速度约为4 cm/h。

（6）萤光现象。抑制剂经纸谱分离后，纸谱上斑点在紫外光下发出蓝色萤光。用NH3或AlCl3处理，能加深斑点黄色和改变萤光颜色。

3）抑制剂的初步提纯和鉴定

花蕾酶液经煮沸去蛋白后，得到黄色上清液，用丙酮∶甲酸∶水（20∶10∶70）进行纸谱分离。单相下行24小时后，抑制剂分布在离底线最远的一端，愈靠近底线抑制剂越少（见表7）。电泳分离后，在纸带上显现出不同的色带，有浅黄、黄、棕黄几种。

不论纸谱或电泳纸上，凡分布有抑制剂处总带黄色。若将经过丙酮∶甲酸∶水系统层析后，纸上分布有抑制剂的最末一段按黄色和无色两部分剪开，用水溶出，结果黄色部分的抑制活力比无色部分高将近4倍。可见抑制剂主要是那些黄色的化合物。

经过丙酮∶甲酸∶水系统层析分离的抑制剂，测定其吸收光谱，发现在260 mμm处有一吸收峰。经紫外光照射15分钟后（15 cm，500 W，220 V），260 mμm的吸收峰消失，随即其抑制活力也丧失（见图4）。

花蕾干粉用丙酮多次抽洗，残余物用重蒸馏水提取，煮沸，去蛋白。上清液经氯仿、苯萃取二次，以除去脂溶杂质。水溶液浓缩，用丙酮∶甲酸∶水纸谱分离，重复二次。纯化后的抑制剂加热浓缩至黄棕色黏状物。用石蜡油为溶剂，用双射式自动记录的红外光谱仪测定红外光谱[2]。由于样品在石蜡油中不溶解，粒子磨不匀，吸收峰很少，仅在1 600 cm-1和1 110 cm-1处有二吸收峰，分别相当于羰基和苯环、类黄酮化合物重要的功能团。

4）不同年龄结实器官内抑制剂含量的变化

如图5所示，抑制剂主要分布在花蕾、花和幼荚中，随着荚子长大，抑制剂逐渐减少，而老荚中几乎消失。