2.方法

1）标记葡萄糖的饲喂和C14 O2的计数

油菜荚剥壳后，小心取出种子（注意不破损种皮）。迅速称取大小颜色均匀的种子2克，置于容量为50 ml的康惠皿（Conway dish）中。皿内加0.01 mol/L、pH 6.5的磷酸缓冲液4.6 ml，中央井内放入玻璃小碟1只，内加20%KOH 0.3 ml，皿缘涂上凡士林。最后向皿内加标记葡萄糖0.4 m（l相当2μc左右）。立即盖上玻璃盖，摇匀，用橡皮圈扎紧，以免漏气。在恒温箱中保温，中途摇几次。待保温时间结束后，用扁头镊子取出康惠皿中的玻璃小碟，于红外灯下烘干，用盖革氏计数管计数。预备试验表明上述的反应条件是令人满意的。皿中不必另加非标记葡萄糖，否则会冲淡标记葡萄糖的浓度，降低标记CO2的放出。至于不同标记葡萄糖含有非标记葡萄糖的量虽然不等，但比活性均很高，非标记葡萄糖的量与种子葡萄糖含量相比可以忽略。虽在各次试验中，喂入不同标记的葡萄糖的放射性强度尽可能相等，但有时脉冲数可能有些上下，所以均换算成喂入脉冲数相等时的C14 O2产率，以便比较。所有试验均为二次结果的平均值。

2）种子中标记葡萄糖转化产物的分离

醇溶物——上述喂过标记葡萄糖的种子洗去种皮表面的放射性葡萄糖，用80%热酒精杀死。磨碎种子，用80%热酒精提取6～7次，每次酒精6～7 ml，最后于红外灯下浓缩干，用石油醚洗三次，待干后加水4 ml溶解，吸0.1 ml铺样记数，剩余的3.9 ml作为糖、有机酸和氨基酸分析之用。

糖、有机酸和氨基酸——基本上按照Canvin等（1961）的方法，将剩下3.9 ml醇溶物通过Zerolite 22（5H+型，200/400 mesh，0.7×7 cm2）阳离子交换树脂，用50 ml 80%酒精冲洗，流下的糖和有机酸再通过Dowex-1×8（甲酸型，200/400 mesh，0.7×7 cm），仍用80%酒精冲洗，洗下者为糖。后用50 ml 2N NH4OH洗下阳离子交换树脂上的氨基酸和用4N甲酸洗下阴离子交换树脂上的有机酸。最后糖、有机酸和氨基酸分别浓缩至干，用80%酒精溶解，铺样记数。

脂溶物——剩下的种子残渣用丙酮提取6～7次，与上述石油醚洗液合并，得到脂溶物。

蛋白质——上述残渣用0.4%NaOH抽提4次，清液加三氯乙酸，使浓度成5%，得到蛋白质沉淀。加一定量的NaOH，吸出一部分铝碟上烘干，测定放射性强度。(https://www.daowen.com)

淀粉——基本上按Pucher等（1948）的方法。剩下的残渣加4 ml水煮沸20分钟，使淀粉糊化，再加60%过氯酸（4 ml），使总浓度成30%。摇匀，立即离心。清液加7.5 ml NaCl（20%），再加2.5 ml碘-碘化钾溶液。将沉淀下来的淀粉-碘复合物离心，用NaCl（2%）-酒精（70%）洗一次，再用80%酒精洗2次。最后，用少量酒精洗出，于铝碟中烘干记数。

粗纤维——残渣加2 ml浓硫酸，使之糊化，取1.0 ml铺在玻璃碟中测定放射性强度。

3）葡萄糖脱氢酶

按照McLean（1958）的方法，用日立分光光度计测定在340 mμm，波长处NAD的还原。酶液制备是相当于1克鲜重的丙酮粉（丙酮粉制备法见施教耐等1965a）加9 ml 0.15 mol/L含1.6×10-4 mol/L KHCO3的KCl研磨，离心，取上清液。反应液中包含双甘氨肽（pH 7.5）125 μmoles，葡萄糖100 μmoles，NAD 0.3 μmoles，酶液0.5 ml，空白者缺NAD，总体积3 ml。于室温下测定。

4）葡萄糖醛酸还原酶

参照Isherwood等（1961）的方法。反应液含Tris，pH 7.5，120 μmoles，KCl 300 μmoles，葡萄糖醛酸10 μmoles，烟碱酰胺40 μmoles，NADPH 0.5 μmoles，酶液0.5 m（l制备方法同上）。空白缺葡萄糖醛酸，总体积3 ml。用日立分光光度计测定NADPH在340 mμm吸收峰的减少。