3.方法

1）静止细胞诱导培养方法

（1）菌丝体生长培养条件。

种子斜面：见前文（朱雨生等，1978）。

生长培养基（%）：甘油0.6，（NH4）2SO40.14，KH2PO4 0.2，尿素0.03，MgSO4·7H2O 0.03，CaCl2 0.03，蛋白质0.1。含微量元素（毫克/升）：FeSO4·7H2O 5.0，MnSO4·H2 O 1.56，ZnCl2 1.67，CoCl2 2.0，pH 5.3。500毫升三角瓶中装入100毫升培养基，孢子悬浮液接种（接种量影响生长和产酶量，一般每毫升孢子数约106个），在往复式摇床（108次/分）上于30℃左右（超过34℃，菌丝体诱导活力下降）震荡培养二天左右，将菌丝体取出，洗去培养基，换用无碳源的培养基，作诱导测定。

（2）菌丝体洗涤方法。

于3号细菌漏斗上铺一张滤纸，将上述三角瓶中的培养物全部倒入抽滤，滤去培养基，留在滤纸上的菌丝体用200毫升磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH 5）洗涤，抽干。菌丝体饼取出，悬浮在50毫升上述缓冲液中，取一部分立即作诱导测定（冰箱中长时间放置会导致失活）。另取一部分于80℃烘干，称干重，并换算成下面每个测定瓶中加入的菌丝体重量（以毫克/瓶表示）。

图1　槐糖对木霉EA3-867菌丝体纤维素酶合成的诱导作用

菌令48小时；菌丝体重量8，4 mg/瓶；槐糖浓度5×10-4 mol/L；诱导温度30℃。

（3）诱导测定方法。

诱导培养基同生长培养基一样，但不含甘油和蛋白胨，使菌丝不能生长。25毫升三角瓶或容量瓶中，加入诱导培养基2.45毫升（浓度高1倍），菌丝体悬浮液2.45毫升，槐糖0.1毫升（最终浓度10-4或5×10-4 mol/L），塞上棉花塞或瓶塞，于往复式摇床或恒温震荡器（100次左右/分）30℃左右震荡培养。一般菌丝体与槐糖接触，经过3小时左右的延迟期，即出现纤维素酶活力，24小时后可达高峰（见图1）。由于培养基中无碳源，偏酸性，加入的菌丝量较多，测定时间又短，故不易染菌，整个操作过程不必无菌操作。本法也是定性地鉴定纤维素酶诱导剂的有效方法，在上述标准测定中，凡是具有同槐糖一样，能诱导菌丝体形成纤维素酶的物质的，即是诱导剂。

2）纤维素酶活力测试

（1）酶液制备：胞外酶和胞内酶制备方法详见前文（朱雨生等，1978），一般酶活力测定取上述诱导培养滤液。

（2）纤维素酶活力测定方法：以分解羧甲基纤维素的CMC酶活力（Cx）作代表。Cx和纤维二糖酶测定方法见前文（朱雨生等，1978）。在规定条件下每产生0.5毫克葡萄糖定为1个活力单位（u），每个测定均换算成每毫升滤液的酶活力单位数（u/ml）。