洗涤菌丝体纤维素酶的诱导形成

1.洗涤菌丝体纤维素酶的诱导形成

1）菌丝体生长条件的影响

（1）碳源。EA3-867能在各种碳源中生长（见表1），但在甘油中生长最好，纤维二糖、麦芽糖、蔗糖和乳糖等双糖中生长较差。在所有碳源中生长的菌丝体都能被槐糖诱导形成纤维素酶，但菌丝体生长量的不同直接影响诱导产酶能力。生长量多的，一般产酶也高。同一碳源中培养的菌丝体，加入到诱导测定中的量越多，产酶量也越高。有意思的是，在纤维二糖中菌丝生长虽差，但诱导活力却较高，此与前文中我们推测纤维二糖在生长过程中可能转化为真正的诱导剂是一致的。

（2）营养盐。氮、磷、镁和钙等元素的无机盐及蛋白胨对于EA3-867菌丝体的生长是必须的。并直接影响到纤维素酶的形成（见表2）。缺镁时，不能生长；既缺钙又缺微量元素时，生长所受影响不大，但孢子形成加快，菌丝产酶能力却剧减；微量元素中铁和锌对生长是需要的，钴看来对生长有抑制。但是对菌丝产酶而言，生长过程中只需锌离子，其他三种微量元素影响不大，甚至不利，此与其他作者报道一致（Mandels等，1957）。

2）诱导条件的影响

（1）营养盐。槐糖诱导EA3-867纤维素酶的形成需要氮、磷、铁、锰离子，其中氮和磷的影响最大，氮素中尤以硫酸铵为重要（见表3）。曾比较了不同氮源的影响，发现尿素和硝态氮都不如氨态氮。在缺氮培养基中震荡3小时后，补加氮素，则最终酶活力可追上对照，而缺氮的影响主要表现在诱导初期，如诱导6小时，酶活力只及对照的一半，到24小时则相当于对照的90%，缺磷也是同样的趋势。此可能与诱导过程中动用菌体自身分解产生的氮和磷有关，因为在培养7小时后，菌丝体约已减重1/4左右。

生长培养基和诱导培养基中营养盐对槐糖诱导EA3-867洗涤菌丝体纤维素酶形成的影响归纳在表4中。

（2）槐糖（诱导剂）浓度。极微量的槐糖（10-6 mol/L，相当于0.34 ppm）便对纤维素酶有明显的诱导作用。浓度升高，诱导活力也增加。7小时测定时，10-5～10-3 mol/L槐糖作用差不多；24小时测定时，10-3 mol/L槐糖的诱导活力为最高；48小时测定时，则以10-2 mol/L槐糖的诱导活力为最高（见图2）。这说明诱导时间延长，槐糖被消耗，造成浓度不足。

（3）诱导温度。最适宜温度在30℃左右。随着温度的降低，延迟期便延长，产酶量也降低，Q10＞2（见图3）。

（4）诱导pH。菌丝产酶的pH范围较广，偏酸性，从pH 3～6均适宜，最适pH在5左右（见图4）。碱性条件显然不利于产酶。

（5）菌令。孢子萌发不久刚长出肉眼可见的短菌丝（15小时）时，洗去甘油，进行槐糖诱导测定，便发现此幼令的菌丝已具有合成纤维素酶的能力，表明控制纤维素酶合成的遗传装置和蛋白质合成系统，在生长早期就在菌丝体中形成。随着菌令的增长，菌丝的生长，总的产酶量也随之增高。72小时后，菌丝体开始自溶，活力便下降（见图5）。

（6）培养方式和通气条件。震荡条件下菌丝体诱导形成纤维素酶的产量远远超过静止培养，说明产酶与通气有关。在诱导过程中通入氧气，可以增加产酶；抽去空气，灌入氩气，则酶不能诱导产生，即使在诱导3.5小时后恢复空气，纤维素酶也不再形成（见表5）。

（7）诱导中途洗去槐糖的影响。菌丝体与槐糖的持续接触，对于纤维素酶的不断形成是必须的。若在菌丝体与槐糖一起震荡培养的不同时间，用细菌漏斗抽滤，除去槐糖，并用磷酸盐缓冲液洗涤菌丝体，后者悬浮在缺槐糖的诱导培养基中作诱导测定，可以看到，纤维素酶的合成不久便停止（见图6）。洗去槐糖的时间越早，影响越大。一般在洗去槐糖后的90分钟至120分钟，纤维素酶的产生便低于对照。

表6是诱导4小时后，改换培养基或菌丝体对纤维素酶形成的影响。试验1中，改换新的培养基（包括槐糖和营养盐）后，产酶明显增加。但换用新的菌丝体，对酶合成影响不大，说明诱导中途（4小时）进一步影响产酶的主要限制因子是培养基的消耗，而不是菌丝体的衰老。从试验2中，则进一步可知，培养基中限制产酶的主要成分是槐糖，而不是无机盐。到诱导后期（24小时），菌丝体的衰老和解体将成为限制产酶的重要因素。

（8）不同诱导剂的比较。曾研究纤维素粉、稻草纤维素、纤维二糖及槐糖对EA3-867洗涤菌丝体诱导形成纤维素酶的能力作了比较。在槐糖（10-4 mol/L）诱导下，24小时纤维素酶（Cx）活力达到22 u/ml，值得注意的是，纤维素粉、稻草纤维素（0.5%）和不同浓度的纤维二糖（10-4～10-2 mol/L）都不能诱导形成纤维素酶。

（9）菌种。各种木霉菌种的菌丝体均能不同程度地被槐糖诱导形成纤维素酶（见表7），且诱变菌株合成纤维素酶的能力高于野生型菌株。但是，槐糖对具有纤维素分解能力的曲霉T17.5-24及产黄色纤维单胞杆菌（D菌）的诱导能力极低。

3）Cx酶和纤维二糖酶的胞内胞外分布

EA3-867洗涤菌丝体被槐糖诱导形成的纤维素酶的不同组分在细胞内外的分布有着一定的规律。纤维二糖酶分布在胞内，Cx酶主要分布在胞外（见图7）。但是，在诱导初期（4小时），胞内的Cx酶略高于胞外，以后胞内Cx酶变化不大，而胞外的Cx酶直线上升。Cx酶在胞内胞外的这种消长变化与生长培养时的规律一致（朱雨生等，1978），这意味着Cx酶先在细胞内合成，接着迅速地向细胞外分泌。C1酶（棉花糖表示）也是分泌到胞外。(https://www.daowen.com)

4）纤维素酶诱导形成与呼吸代谢的关系

EA3-867洗涤菌丝体同槐糖保温的同时，加入不同的呼吸抑制剂，如碘乙酸、氟化钠，丙二酸、迭氮化钠和DNP，测定对纤维素酶诱导形成的影响（见图8），证明各种呼吸抑制剂对菌丝体产酶都有明显的抑制作用。

5）纤维素酶诱导形成与核酸代谢的关系

EA3-867洗涤菌丝体与槐糖及各种核酸代谢的抑制剂同时保温震荡，测定对纤维素酶形成的影响。结果如表8、表9和图9所示。从表中可知，放线菌素D、放线菌酮、6-氮杂尿嘧啶和5-氟尿嘧啶对纤维素酶的合成均有不同程度的抑制作用。其中放线菌酮的抑制作用最强，在1～10微克/毫升的浓度范围，对纤维素酶的合成便有明显的抑制作用。但到24小时后，纤维素酶的合成往往可以恢复。EA3-867纤维素酶的合成对放线菌素D不太敏感，当浓度高到100微克/毫升时，才有部分的抑制作用。曾试图用EDTA（10-3 mol/L）处理菌丝体（Perlman等，1968），以及超声波破碎细胞的方法，以排除透性的影响，但均不能增加EA3-867对放线菌素D的敏感性。由表9可知，利福霉素对EA3-867纤维素酶的形成无明显的抑制作用。

若EA3-867菌丝体与槐糖预保温4小时，让mRNA充分形成，然后，加入放线菌素D，放线菌酮和6-氮杂尿嘧啶，震荡培养不同时间，测定对纤维素酶合成的影响（见图10）。结果发现6-氮杂尿嘧啶，尤其是放线菌酮，对纤维素酶合成有明显的抑制作用，而放线菌素D抑制不明显，直至培养20小时，才表现若干抑制作用。