3.方法

3.方法

（1）纤维素酶制剂制备方法。5升三角瓶中装入1升液体培养基，成分见前文（朱雨生等，1978a）。28℃振荡培养48小时后，抽滤，菌丝体用二倍体积的0.01 mol/L、pH 5.0的磷酸缓冲液洗涤后，转入到1升缺碳源的诱导培养基中（5升三角瓶中），内含槐糖（5×10-5mol/L），于28℃振荡培养24小时，抽滤，取滤液，用80%饱和度的硫酸铵沉淀蛋白，经Sephadex G-25脱盐，冷冻干燥，即得槐糖诱导的胞外纤维素酶制剂。

（2）纤维素酶活力测定方法。

① Cx酶（CMC酶活）：a.还原糖法（Cx（R））见前文B法（中科院上海植生所纤维素酶等，1978），酶活力以毫克糖/毫升酶表示；b.黏度法（Cx（v））：见前文（同上），酶活力以单位（u）/毫升酶表示。

②β-葡萄糖苷酶（β-Gluc）：V0.2毫升适当稀释的酶液，加0.1毫升对-硝基苯葡萄糖苷（0.5%）和0.1毫升0.1 mol/L pH 4.5的醋酸缓冲液，50℃反应30分钟，加4毫升0.1 mol/L Na2 CO3于430 mμm比色，测定释放的硝基苯。酶活力以每毫升酶液释放的硝基苯微克数（微克硝基苯/毫升酶）表示。

③ C1酶（以棉花糖活力表示）：见前文（同上）。

④微晶纤维素活力：V0.25毫升酶液，加0.25毫升0.5%的微晶纤维素和0.5毫升0.1 mol/L、pH4.5的醋酸缓冲液，于50℃下反应4小时，用DNS试剂定糖，酶活力以毫克糖/毫升酶表示。

⑤磷酸膨胀纤维素活力：V 0.5毫升酶液，加0.5毫升0.1 mol/L、pH 4.5的醋酸缓冲液及4毫升0.5%的磷酸膨胀纤维素，于50℃下反应2小时，用DNS试剂定糖。酶活力以毫克糖/毫升酶表示。

（3）电泳。

①聚丙烯酰胺凝胶电泳：V参考Hedrick等的方法（1968），胶长0.59厘米×8厘米，胶浓7%，缓冲液为0.005 mol/L Tris-0.038 mol/L甘氨酸溶液，pH 8.7，电流2毫安/管，氨基黑染色，7%醋酸中退色。在电泳分离纤维素酶时，电泳完毕，参照对照管的染色带位置切割凝胶（见图1），用蒸馏水浸提酶液，调pH至5.0左右，对蒸馏水透析，冷冻干燥。纤维素酶分子量测定时，采用5%、6%、7%和8%胶浓，以牛血清蛋白（三种聚合态）、过氧化氢酶、胃蛋白酶、淀粉酶、乳酸脱氢酶和肌酸激酶等为对照，测量不同胶浓下蛋白的相对泳动，作图求出各种蛋白的斜率，并对分子量作图。C1酶分子量还用SDS凝胶电泳法测定（Weber，1969）。

②醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素薄膜（8厘米×2厘米）直线点样后电泳半小时左右，电压90～110伏，电流0.4～0.6毫安/毫米，氨基黑染色。(https://www.daowen.com)

③免疫电泳：a.纤维素酶抗血清制备：槐糖诱导的胞外纤维素酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳初步纯化的纤维素酶蛋白（以C1酶为主，含Cx酶和β-葡萄糖苷酶）作抗原，加Freund（1∶1 v/v）佐剂，皮下注射兔子，第一次注射为每头兔子2毫克，10天后第二次注射（0.75毫克/头），再隔10天后作第三次注射（1毫克/头）。一个月后，取耳静脉血作效价测定，从颈动脉抽血，制备抗血清。b.电泳方法：琼脂糖（1.2%）溶于0.02 mol/L、pH 8.6的巴比妥酸缓冲液中，铺琼脂板7.5厘米×2.5厘米，纤维素酶抗原点样后于巴比妥酸缓冲液中电泳3小时，电压5伏/厘米，电泳完毕，在琼脂糖板中央开槽，滴入纤维素酶抗血清50微升，于室温扩散24小时，氮基黑染色，7%醋酸中退色。

（4）超离心。

用P hywe超离心机（东德）测定，纤维素酶C1）浓度为10毫克/毫升、缓冲液为0.1 mol/L，pH 4.5的醋酸缓冲液，转速48 000转/分，温度20℃。

（5）糖测定。

① C1酶结构糖分析（Tomita等，1974）：4毫克纯化的C1酶，于2毫升1N H2SO4中水解（沸水浴）4小时，Ba（OH）2中和后，溶液通过阳离子树脂717和阴离子树脂732，去离子后的流出液浓缩，用酚-硫酸法定糖（朱雨生等，1978a）。

②纤维素酶水解产物纸谱分析：见前文（朱雨生等，1978c）。

（6）氨基酸成分测定。

称取4.07毫克纯化的C1酶，于5.4N HCl中，110℃水解24小时。长短柱分别为50和10厘米，上样量0.5毫克。用日制的日立KLA-3B型氨基酸分析仪测定氨基酸成分。