纤维素酶组分的分离与纯化
称取100毫克槐糖诱导的胞外纤维素酶，溶于10毫升醋酸-氢氧化钠缓冲液（0.1 mol/L、pH 5.0）中，先上Sephadex G-75柱，除了去除一部分杂蛋白外，纤维素酶各组分基本上分不开，于是上DEAE-Sephadex A-50柱。
（1）DEAE-Sephadex A-50分离。DEAE-Sephadex A-50预先用醋酸-氢氧化钠（0.1 mol/L、pH 5.0）平衡。上样后，用同样的缓冲液洗脱，在No.4～No.14出现蛋白峰（A），含Cx酶和β-葡萄糖苷酶，但没有C1酶活性。待蛋白含量降为OD280值在0.02以下时（No.40），换用0.1 mol/L、醋酸-氢氧化钠缓冲液和0.1 mol/L醋酸-氢氧化钠-0.5 mol/L NaCl，pH 5.0的梯度洗脱，在No.54～No.68之间出现一蛋白主峰（B）（见图2）。B峰能分解棉花（Cl酶），含有少量的Cx酶。将B峰合并，对水透析40小时，冷冻干燥，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化（见方法部分）。40毫克样品，经四根聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，约得到18毫克较纯的C1酶白色冷冻干燥制剂，此时不含Cx和β-葡萄糖苷酶（见表1）。故经过DEAE-Sephadex A-50和凝胶电泳，首先得到C1酶。
目前文献中报道Cx和β-葡萄糖苷酶分离较困难。本文系用Sephadex G-100凝胶过滤和选择性失活的方法。上述A峰中的Cx和β-葡萄糖苷酶不能用SE-Sephadex C-50分开，故对蒸馏水透析24小时后，冷冻干燥，溶于5毫升0.01 mol/L、pH 5.5的醋酸-醋酸铵缓冲液中，上Sephadex G-100柱。
图2 拟康氏木霉纤维素酶经DEAE-Sephadex A-50柱（18.5×1.8 cm）的离子交换层析图
样品上柱后，先用0.1 mol/L HAc-NaOH缓冲液（pH 5.0）洗脱，流速10 ml/小时，分部收集，每管5.2 ml，到第40管后，换用0.1 mol/L HAc-NaOH和0.1 mol/L HAc-NaOH-0.5 mol/L NaCl（pH 5.0）缓冲液的梯度洗脱，流速20 m/小时，加样后第三管开始收集，每管收集4.3ml。
表1 分离的纤维素酶组分C1、Cx和β-葡萄糖苷酶的底物专一性
注：C1酶是图1中B峰经电泳纯化的组分，浓度为1 mg/ml；CX酶为图2中的D峰部分（0.6 mg/ml）；β-萄葡糖苷酶为图2中C峰（0.5 mg/ml）部分再经选择性失活得到的部分，加酶量约为0.1 ml，测定方法见方法部分。
（2）Sephadex G-100分离Sephadex G-100悬于0.01 mol/L、pH 5.5的醋酸-醋酸铵缓冲液中，于90℃浸泡6小时，装柱。样品上柱后，用同样的缓冲液洗脱，在No.13～No.20之间出现蛋白主峰（C）（见图3），含Cx和β-葡萄糖苷酶。但在No.20～No.27之间肩部（D）只含Cx酶，而不含β-葡萄糖苷酶（见表1），故通过Sephadex G-100分离得到Cx酶。
图3 拟康氏木霉纤维素酶通过Sephadex G-100（88.5 cm×1.9 cm）的凝胶过滤层析图
流速10 ml/小时，每管5 ml。
（3）C1和β-葡萄糖苷酶选择性失活的方法C峰中的Cx和β-葡萄糖苷酶活性最后通过选择性变性的方法分开。即在pH 2.5、0.1 mol/L醋酸缓冲液中，于45℃处理酶液24小时，可使β-葡萄糖苷酶100%失活，而绝大部分Cx酶被保存（见图4）；相反，在pH 7.5、0.005 mol/L Tris-0.038 mol/L甘氨酸缓冲液中，于45℃处理8小时，可使Cx酶100%失活，但保存绝大部分β-葡萄糖苷酶。此法虽不能去除Cx酶蛋白，但可得到不含Cx酶活性，只含β-葡萄糖苷酶活性的组分，以便作下面的重组试验。
纤维素酶三个组分中C1含量最高，得以进一步作纯度鉴定，及研究其性质。
图4 拟康氏木霉Cx酶和β-葡萄糖苷酶的pH稳定性的比较
