二、沉淀反应
沉淀反应（precipitation reaction）是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现可见的沉淀现象。从最初的发现到免疫浊度法的出现，它经过不断的改进与发展，适应了现代测定快速、简便和自动化的要求。
根据反应介质和检测方法的不同，沉淀反应可分为液体内沉淀试验和凝胶内沉淀试验；液体内沉淀试验包括环状沉淀反应、絮状沉淀反应和免疫浊度测定，凝胶内沉淀试验包括免疫扩散试验和免疫电泳技术。
沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体特异性结合，此阶段可以在几秒到几十秒内瞬间完成并出现不可见的可溶性复合物，主要受抗原抗体特异性和结合力的影响。第二阶段为形成可见的免疫复合物，反应慢，需几十分钟到数小时完成，受抗原抗体比例、分子大小、亲和力、绝对浓度、电解质浓度和反应温度的影响；经典的沉淀反应根据此阶段形成的沉淀线或沉淀环来判断结果。
基于网络学说（lattice theory）的沉淀反应原理，参与反应的大多数抗体为二价，天然抗原为多价，两者可相互交联成具有立体结构的巨大网格状聚集体，出现肉眼可见的沉淀物。多克隆抗体可与抗原表面不同表位结合，易交联成网状结构而发生沉淀；单克隆抗体只能结合抗原的单一表位，不易形成交联，因此多克隆抗体适用于免疫沉淀反应，而单克隆抗体不适用。
（一）液体内沉淀试验
经典液体内沉淀试验包括环状沉淀反应和絮状沉淀反应，由于环状沉淀反应和絮状沉淀反应样品需要量大，临床几乎不用。
1.环状沉淀反应（ring precipitation）将已知抗血清和待检抗原反应，在液面交界处特异性结合形成白色环状沉淀。该法可用于微量抗原的检测，操作简单，但灵敏度和分辨力差，只能定性。
2.絮状沉淀反应（flocculation precipitation）抗原与相应抗体特异性结合，在电解质存在的条件下，形成肉眼可见的絮状沉淀物。此方法受抗原抗体比例的影响非常明显，常用于测定抗原抗体反应的最适比例，有抗原稀释法、抗体稀释法和方正滴定法三种操作方法。
3.免疫浊度测定 应用抗原抗体结合在液体中形成的免疫复合物干扰光线可用仪器检测的特点，将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定。其原理：可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者在比例合适和增浊剂作用下，可快速形成一定大小的免疫复合物，使反应液出现浊度。它的最大优点是稳定性好，敏感度高，精确度高，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染。1977年，Sternberg建立的速率散射比浊法是目前定量测定微量抗原物质并广泛使用的一种高灵敏度、快速的自动化免疫比浊测定法。
（1）免疫浊度测定的影响因素：①抗原和抗体的比例：抗原和抗体比例是形成浊度的关键因素，当抗原和抗体的比例适当时，两者全部结合，无抗原抗体过剩，这时免疫复合物（IC）的形成和解离相等。抗原过量可引起高剂量钩状效应（high dose hook effect），致形成的IC分子小，发生再解离，浊度下降，光散射减少。当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增至抗原、抗体比例最适处达最高峰，沉淀反应最明显，称等价带；高峰区域左侧，抗体浓度过高，沉淀反应不明显，称前带；高峰区域右侧，抗原浓度过高，沉淀反应也不明显，称后带，这就是经典的海德堡（Heidelberger）曲线理论。因此，为保证免疫比浊法的准确性，要求在反应体系中保持抗体过量。②抗体的质量：免疫比浊法对抗体的要求：a.特异性强：只针对某一种抗原，与其他无关抗原不发生交叉反应。b.效价高：低效价（＜1∶20）抗体易产生非特异性浊度（伪浊度）。c.亲和力强：加快抗原抗体反应速度的同时形成较牢固的IC，这在速率比浊法中尤为重要。d.使用R型抗体：以家兔为代表的小型动物被注射抗原免疫后制备的抗血清，这类抗血清具有亲和力较强、抗原抗体结合后不易发生解离等优点。③抗原抗体反应的环境：反应液的最适pH值为6.5～8.5，超过此限度不易形成IC，甚至可引起IC解离；磷酸盐缓冲液离子强度大，常作为免疫比浊法的反应液。某些非离子型亲水剂（如聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、吐温-20（tween-20）等）对促进IC的形成有显著的增强作用。
（2）免疫比浊法分类：①根据抗原抗体反应的时间和反应结合的动力学分为：a.速率比浊法：利用抗原抗体特异性结合快速形成复合物阶段测定免疫复合物形成的速率。b.终点比浊法：测定沉淀反应形成可见的免疫复合物阶段形成的复合物的量。②根据检测仪器的位置及光信号性质分为：a.透射免疫比浊法：根据光吸收、衍射、反射和折射后光减弱的变化对免疫复合物进行定量。b.散射免疫比浊法：根据光折射和衍射形成的散射光强度来定量免疫复合物。
（二）凝胶内沉淀试验
凝胶内沉淀试验（gel phase precipitation）是利用可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。适宜浓度的凝胶实际上是一种固相化的缓冲液，呈网络结构，将水分固相化，抗原和抗体蛋白质在凝胶内扩散如在液体中自由运动。分子质量在200 kD以上的大分子物质在凝胶中扩散较慢，据此特性可识别分子量的差别。此外，形成的免疫复合物因分子量超过凝胶网孔的限度而被网在凝胶中，形成沉淀，经盐水浸泡也只能去除游离的抗原或抗体，便于后面的分析。
1.免疫扩散试验 根据抗原与抗体反应的方式和特性，免疫扩散试验可分为单向免疫扩散试验（single immuno diffusion test）和双向免疫扩散试验（double immuno diffusion test）。
1）单向免疫扩散试验 单向免疫扩散试验是先将一定量的抗体混于琼脂凝胶中，使待测的抗原溶液在琼脂内由局部向周围自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。根据试验形式可分为试管法和平板法两种，试管法因沉淀环不易观察及定量，目前较少应用。
（1）平板法：由Mancini于1965年提出，是将一定量的已知抗体混于琼脂凝胶中制成琼脂板，在适当位置打孔，加入抗原，在适度温度和一定时间后，孔内抗原环状扩散形成浓度梯度环，在抗原、抗体比例合适处形成沉淀环。最后测量沉淀环的直径或计算环的面积，环的直径或面积的大小与抗原含量呈正相关。
（2）抗原量与环直径的关系：本法为经典抗原定量技术，在检测标本的同时鉴定5～7个不同浓度的抗原标准品，并测量沉淀环的直径，按扩散时间的不同制出标准曲线，可从标准曲线中查出标本中的待检抗原含量。常用于IgG、IgA、IgM、C3、C4等血浆蛋白的测定。有两种计算方法：①Mancini曲线：适于处理大分子抗原和长时间（＞48 h）扩散的结果，抗原浓度（C）与沉淀环直径的平方（d2）呈线性关系，常数K=C/d2。②Fahey曲线：适于处理小分子抗原和较短时间（＜24 h）扩散的结果。抗原浓度的对数（logC）与沉淀环直径（d）呈线性关系，常数K=logC/d，用半对数坐标纸画曲线，则为Fahey曲线。(https://www.daowen.com)
（3）影响因素：单向扩散试验是定量测定抗原的方法，若操作规范，其重复性和线性均好，但灵敏度稍差（不能测定μg/mL以下含量）。另外，应注意下列影响因素：①抗血清要求亲和力强、特异性好和效价高；②每次测定必须制作标准曲线，同时须测定质量控制血清；③结果与真实含量不符情况主要发生在Ig测定中；④双重沉淀环现象多是由不同扩散率但抗原性相同的两个组分所致。
2）双向免疫扩散试验 双向免疫扩散试验是将抗原和抗体加在同一琼脂板对应孔中，各自向对方扩散，在浓度比例恰当处形成沉淀线，观察沉淀线的位置、形状及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。此法灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量，这些弱点在相当程度上限制了它的应用。
2.免疫电泳技术 免疫电泳技术（immunoelectrophoresis technique）是电泳分析与沉淀反应的结合产物，是直流电场作用下的凝胶扩散试验，是将抗原抗体反应的高度特异性与电泳技术的高分辨率及快速、微量等特性相结合的一种免疫化学技术。该技术的优点：①加快了沉淀反应的速度；②抗原抗体的扩散方向固定集中，提高了灵敏度；③可先将蛋白组分所带电荷分开，再与抗体反应。随着免疫检测技术的不断发展，免疫电泳技术包括为对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫电泳、免疫固定电泳等多项实验技术，并在科学研究和临床实验诊断中广泛应用。
1）对流免疫电泳 对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis，CIEP）实质上是将双向免疫扩散与电泳相结合在直流电场中的定向加速的免疫扩散技术。在pH 8.6的缓冲液中，大部分蛋白质抗原等电点低，带较强的负电荷，分子量小，受到电渗作用小，在电场中向正极移动；而抗体绝大多数为IgG，等电点偏高，在pH 8.6时带负电荷较少，且分子量较大，移动速度慢，它向正极移动缓慢甚至不移动，而在电渗作用下，随水流向负极移动，电渗引向负极移动的速度超过了IgG向正极的移动速度，因此抗体移向负极，在抗原抗体浓度比例最适处形成沉淀线，根据沉淀线相对于两孔的位置可大致判断抗原抗体的比例关系。实验时在琼脂板两端打孔，并标上正极与负极，将抗原溶液加在负极侧的孔内，相应抗体则放入正极侧的孔内，通电，带负电荷的抗原向正极泳动，抗体借电渗作用向负极泳动，在两者之间或抗体的另一端（抗原过量）形成沉淀线。若抗原浓度高于抗体，沉淀线靠近抗体孔；抗原浓度越高，沉淀线越接近抗体孔，甚至超过抗体孔（图19-7）。
本试验简便、快速，比双向免疫扩散法灵敏度提高8～16倍，可测出蛋白质的浓度达μg/mL。常用于抗原或抗体的性质、效价和纯度的测定。
IgG在对流免疫电泳中有其特殊电泳形式：一部分泳向正极，另一部分泳向负极。IgG3和IgG4与一般蛋白质相同，泳向正极；IgG1和IgG2带电荷少，受电渗的作用力大于电泳，而向负极移动。因此其对流只是部分IgG的电渗作用所致。此方法不适合于抗原为免疫球蛋白或抗原抗体迁移率接近的情况，否则会导致抗原抗体朝同一个方向泳动。
图19-7 对流免疫电泳结果示意图
①Ag为阳性；②Ag为弱阳性；③Ag为强阳性；④Ag为强阳性
2）火箭免疫电泳 火箭免疫电泳（rocket immune electrophoresis，RIE）是单向免疫扩散与电泳相结合的一项定向加速的单向扩散试验。它是将抗体混合于琼脂中，电泳时，抗体不移动，抗原由负极向正极泳动，并随抗原浓度的减小，抗原泳动的基底区也逐渐变窄，免疫复合物形成的沉淀线也越来越窄，形成一个火箭状的不溶性复合物沉淀峰。当琼脂中抗体浓度不变时，沉淀峰的高度与抗原量呈正相关，用已知标准抗原作对照，绘制标准曲线，就可根据沉淀峰的高度在标准曲线中计算出待测样品浓度。反之，固定抗原的浓度，便可检测抗体的含量（称为反向火箭电泳）。
火箭电泳只能测定μg/mL以上的含量，如低于此水平，则难以形成可见的沉淀峰。但利用加入125I标记的标准抗原共同电泳，经X线胶片显影，可出现放射显影，其原理为免疫自显影技术，其灵敏度可达ng/mL。常用于IgA、IgG等蛋白定量。
3）免疫电泳 免疫电泳（immunoelectrophoresis，IEP）是先将蛋白质抗原在凝胶中做区带电泳，根据其所带电荷、分子量和构型不同分成不可见的若干区带，然后，沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清，进行双向扩散，两者比例适合处形成弧形沉淀线。通过对沉淀线的数量、位置和形态与已知标准抗原抗体生成的沉淀线比较，可对待测样品中所含成分的种类和性质进行分析。
4）免疫固定电泳 免疫固定电泳（immunofixation electrophoresis，IFE）是区带电泳和沉淀反应相结合的一项免疫化学分析技术。该方法的原理为先将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上经区带电泳分离，再将固定剂和各型免疫球蛋白及轻链抗血清加于凝胶表面的泳道上，经孵育，固定剂和抗血清在凝胶内渗透并扩散，抗原抗体直接发生沉淀反应，洗脱游离的抗体，形成的免疫复合物则保留在凝胶中。再通过漂洗与染色，呈现浓而窄的着色区带。根据电泳移动距离分离单克隆组分，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型。
本法用于鉴定迁移率相近的蛋白和M蛋白，免疫球蛋白轻链，尿液、脑脊液等微量蛋白，游离轻链，补体裂解产物等；临床最常用于M蛋白的鉴定。免疫固定电泳最大的优势为分辨率高，敏感度高，操作周期短，结果易分析，目前已作为常规检测。
5）交叉免疫电泳 交叉免疫电泳（crossed immunoelectrophoresis，CIEP）是区带电泳与火箭免疫电泳结合的一项免疫电泳分析技术，是一种有效的抗原蛋白定量技术。一次可对多种抗原定量，分辨率较高，适用于比较各种蛋白组分，定性分析蛋白质遗传多态性、微小异质性、裂解产物和不正常片段等。
6）自动化免疫电泳 近年自动化免疫电泳仪的推出，使得自动化免疫电泳技术得到了广泛的推广。它解决了传统电泳技术手工操作不易标准化和耗时长的问题，只需人工加标本、固定剂和抗血清，其余步骤均实现自动化。它包括电泳系统（自动化电泳仪）和光密度扫描系统，具有分辨率高、重复性好等优点。