细胞因子的检测
细胞因子是由机体活化的免疫细胞及某些基质细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥生物学作用。众多细胞因子在体内通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性，形成了十分复杂的细胞因子调节网络，参与人体多种重要的生理功能。所以细胞因子检测是判断机体免疫功能的一个重要指标，对于疾病的诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测等都有重要意义。细胞因子可分为6大类：白介素（IL）、干扰素（IFN）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）、趋化因子、生长因子。
（一）生物学检测方法
常见的生物学检测法包括基于DNA检测的分子生物学测定法和生物活性测定法。
1.促进细胞增殖和抑制细胞增殖测定法 以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察刺激或抑制依赖细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。检测指示细胞增殖的方法大致有以下三类：①直接计数法；②细胞代谢活性测定方法；③细胞代谢产物测定法。
2.功能检测 利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的活性测定方法。在这里可以利用干扰素的抑制病毒感染效应，对已进行病毒感染的细胞群加入干扰素后的特征进行观察，达到检测的目的。①细胞毒活性测定法：对靶细胞具有破坏作用的细胞因子，如TNF等，与细胞共育将会导致细胞死亡。待测细胞因子做一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性成正比。②抗病毒活性测定法：主要用于IFN等细胞因子的检测。③趋化活性测定法：趋化因子如IL-8、IL-16等，能诱导中性粒细胞、单核巨噬细胞或淋巴细胞等，由趋化因子低浓度处向高浓度处做定向移动。趋化活性可采用琼脂糖和Boyden盲端微孔小室趋化试验测定（图19-12）。
图19-12 Boyden小室侵袭模型
3.生物学活性测定 方法学评价细胞因子生物学活性测定，是基于其生物学活性所设计的一类方法，对细胞因子前体或其降解产物、与可溶性受体结合的细胞因子、细胞因子聚合物等，均不能用此法检测。细胞因子受体拮抗物、细胞因子的天然抗体和类细胞因子等，也将干扰细胞因子活性的测定。
细胞因子生物学活性测定法主要具有以下特点：①敏感性较高；②特异性不高；③操作烦琐；④易受干扰。
（二）免疫学检测方法
1.流式细胞仪检测 主要用于细胞内细胞因子和细胞表面黏附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，用流式细胞仪分析荧光阳性细胞百分比和荧光强度能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或细胞黏附分子的检测，精确判断不同细胞亚群的细胞因子和膜分子的表达情况。此外，若应用不同荧光素标记2种以上细胞因子的单克隆抗体，则可同时检测同一细胞内2种以上不同的细胞因子。应用此法还可区分具有不同分泌特性的细胞亚群，如Th1、Th2细胞等。
2.酶联免疫吸附试验（ELISA）测定的标本主要包括血清（血浆）、关节液、胸腔液、脑脊液或腹腔液等体液和细胞培养上清液。可用多克隆抗体或单克隆抗体，可做定性或定量分析。其优点是特异、简便、易于推广和标准化，可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理。主要方法有：①间接ELISA（indirect ELISA）用于筛检抗体（抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体最常用的方法。②夹心ELISA（sandwich ELISA）用于检测目的抗原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记，但增加了操作步骤和测定时间。③竞争ELISA（competitive ELISA）用于确定抗原特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要用于测定小分子抗原。④高通量细胞因子检测CBA（cytometric bead array）是一种微珠多用途检测分析技术，它由一系列的微珠组合来捕获并结合流式细胞仪技术检测细胞培养液、EDTA血浆、血清样本中被检测物质的量。其采用夹心法分析策略，与传统的ELISA分析技术相比，此方法可以同时检测多项指标。用已知的标准品和对照标准曲线就可以得出被测样本的浓度。此分析方法不受样本量的限制，而且可以得到一个样本的多个数据。
3.酶联免疫斑点试验（ELISPOT）ELISPOT源自ELISA，但又突破传统ELISA，是定量测定抗体形成细胞技术的延伸和发展，已被愈来愈多地被应用于类风湿因子、IFN-γ等细胞因子分泌细胞的定量测定。(https://www.daowen.com)
ELISPOT优于传统抗体、细胞因子或其他可溶性分子分泌细胞的检测方法，能从20万～30万个细胞中检测出1个分泌相应分子的细胞，若引入生物素与亲和素系统，敏感性还将大大提高。在进行ELISPOT时，选择的特异性抗体应该具有高亲和力、高特异性、低内毒素的特性。选用的细胞激活物必须不影响细胞的分泌功能。
4.免疫学检测方法的比较
（1）ELISPOT相比ELISA的优势：①ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过计算机辅助的分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）。②由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA更灵敏，能从20万～30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。③捕获抗体具有高亲和力、高特异性、低内毒素的单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
（2）夹心ELISA的缺点：不能显示出单个细胞产生细胞因子的同一性和频率性的直接信息。
（3）流式细胞仪检测特点：①快速。②简便：不需组织培养，可以全血分析，无须分离PBMC。③灵敏度高：荧光标记与检测系统高度灵敏。④高效：在同一细胞内同时检测2种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群。⑤接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境，更准确反映了体内状况。
（三）生物学检测法与免疫学检测法的比较
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能，是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单、迅速，重复性好，但所测定的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感度也低于生物学检测法（低10～100倍）。
（四）细胞因子与细胞黏附分子检测的临床应用
免疫系统的各组织或器官具有广泛、散在分布的解剖学特点，因此，细胞因子、细胞黏附分子是免疫系统功能发挥的信息传递者和效应显现形式，对其检测已成为研究者和临床工作者的共识。
细胞因子与细胞黏附分子的异质性、功能交叉性和多样性、来源的复杂性和组织细胞的非特异性，决定了在进行这些分子检测时，必须对方法选择和结果判断做出综合考虑（包括方法是否联合应用，如何适当选取标本以及是否对细胞因子进行联合检测）。细胞因子与细胞黏附分子检测在特定疾病的研究和诊断中有特殊意义，是许多特定疾病诊断的辅助指标。机体免疫状态与疾病的发生、发展和预后密切相关；机体免疫应答的强弱，也可以通过细胞因子或细胞黏附分子的表达水平来反映。
此外，通过人为调整患者体内的细胞因子水平可达到治疗目的，人工重组细胞因子已在临床疾病的治疗方面发挥了重要作用。