9.5.4　操作步骤

1）制片

（1）抹片

首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置载玻片的水滴中与水混合并涂抹开，注意涂抹要均匀平坦，涂抹后直径约为1 cm的薄层。

（2）固定

将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳，待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，这样重复操作直到薄层干了为止。

2）染色

（1）初染

在涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫染液，染色1～1.5 min，然后用细小的水流从标本上端冲净残余染液（注意勿使水流直接冲洗涂菌处），至流下的水为无色。

（2）媒染(https://www.daowen.com)

滴加路哥氏碘液覆盖菌膜，媒染1～1.5 min，然后用流水冲洗掉多余的碘液。用吸水纸吸干载片上的水分。

（3）脱色

倾斜玻片并衬以白色背景，流滴95%乙醇冲洗涂片，同时轻轻摇动载片使乙醇分布均匀，至流出的乙醇刚刚不出现紫色时即停止脱色，并立即用水冲净乙醇。

这一步是染色成败的关键，必须严格掌握酒精脱色的程度。脱色过度，则阳性菌会被误认为阴性菌；脱色不足阴性菌也可被误认为阳性菌。

（4）复染

滴加番红染液，染色1～2 min，水洗后用滤纸吸干水分。

3）镜检

先用低倍镜，再用高倍镜和油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈蓝紫色。