9.11.4 操作步骤
1）微生物细胞大小的测定
目镜测微尺的校正方法如下所述。
把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图9.5），计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数，因为镜台测微尺的刻度每格长10μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
图9.5 目镜测微尺与镜台测微尺校准
目镜测微尺每格长度（μm）=两条重合线间镜台测微尺的格数×10两条重合线间目镜测微尺的格数
例如，目镜测微尺5小格正好与镜台测微尺5小格重叠，已知镜台测微尺每小格为10μm，则目镜测微尺上每小格长度为5×10μm/5=10μm，用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用，当更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。
2）细胞大小的测定
①将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液（10-2）。
②取1滴酵母菌菌悬液制成水浸片。
③移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长、宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘以目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10～20个菌体，求出平均值，才能代表该菌的大小。而且一般是用对数生长期的菌体进行测定。
④同法用油镜测定枯草杆菌染色标本的长和宽。
3）微生物细胞数量的测定
（1）稀释样品(https://www.daowen.com)
视待测菌悬液浓度，加无菌水适当稀释（斜面一般稀释到10-2），以每小格的菌数可数为度。
（2）检查计数室
加样前，镜检清洗后的计数板，直至计数室无污物和菌体后才可使用。
（3）加样
取洁净干燥的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。将酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片后，造成计数区深度的升高。然后，加盖盖玻片（勿使产生气泡）。
（4）显微镜计数
静置片刻，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数室方格后，再转换高倍镜观察并计数。由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度，以既可以看清菌体又可以看清方格的线条为宜。计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数，一般要求样品稀释到每小格内有5～10个菌体为宜。计数时若计数室是由16个中方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格（即一共100小格）的菌数。如果是25个中方格组成的计数室，除数上述4个中方格外，还需数中央1个中方格的菌数（即一共80个小格）。如菌体位于中方格的双线上，计数时则按计上不计下，计左不计右的原则，以减少误差。对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2～3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作）。
（5）清洗计数板
测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
（6）计算
按下列公式计算出每毫升菌悬液所含酵母菌细胞数量。
25（中方格）×16（小方格）的计数板：细胞总数/mL=N/5×25×10 000×稀释度
16（中方格）×25（小方格）的计数板：细胞总数/mL=N/4×16×10 000×稀释度
式中 N——测得的5或4个中方格的总菌数，稀释度表示样品的稀释倍数。
