9.16.3 操作步骤
1）环状沉淀试验（以炭疽杆菌为例）
①抗原制备：取可疑患炭疽死亡病畜皮肤或肝脏约1 g放试管或小三角瓶中，加生理盐水510 mL，煮沸30～40 min。冷却后按最初量补足生理盐水，用滤纸过滤3～4次，取澄清液作为待检抗原。如检样为皮张时可用冷浸法，将检样置于37℃温箱中烘干，经高压灭菌后剪成小块称重，然后加入5～10倍的0.3%碳酸生理盐水，置温室下浸泡18～24 h，同上法过滤取澄清液体作为沉淀原。
②取3支小试管，用毛细血管加0.1 mL炭疽沉淀血清（注意液面勿有气泡）。
③取其中1支毛细血管将待检抗原沿管壁轻轻加入，使其重叠在炭疽沉淀血清之上，上下两液间有一整齐界面（注意加液时动作轻缓，勿使产生气泡）。
④另两支小试管作对照，1支加炭疽阳性抗原，1支加生理盐水，方法同上（注意毛细血管必须专用，不能混乱使用）。
⑤在5～10 min内判断结果，上下重叠的两界面上出现乳白色环者为炭疽阳性，证明被检动物死于炭疽。加炭疽阳性抗原的对照管应出现白环，另一对照管则否。
2）琼脂扩散沉淀反应
抗原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶基质中可以向四周自由扩散，如果二者是相应的具有特异性，则在一定部位相遇，并发生反应，出现肉眼可见的白色沉淀线。此种反应为琼脂扩散沉淀反应。(https://www.daowen.com)
由于一种抗原可能含有数种抗原成分，因而在凝胶中的扩散速度也不一样，所以在凝胶中可以和抗血清形成数条沉淀线，每一条沉淀线即代表一种抗原成分。所以琼脂扩散反应除用作微生物的鉴定、疾病诊断外，还可用作抗原成分的分析。该反应的操作如下：取精制琼脂干粉1～1.2 g，放入含0.1‰硫柳汞的磷酸缓冲液（PBS）或硼酸缓冲液（BBS）中，水浴加热融化混匀。
图9.7 琼脂扩散反应图
①融化后以两层纱布夹薄层脱脂棉过滤，除去不溶性杂质。
②将直径90 mm的洁净平皿放在平台上。每平皿倒入热的琼脂15～18 mL，厚度约2.5 mm。注意不要产生气泡，冷凝后加盖，把平皿倒置，防止水分蒸发，放在普通冰箱中保存2周左右。
③将琼脂平皿放于事先绘制好的图案上，用打孔器照图案打孔，外周孔径为6 mm，中央孔径为4 mm，孔间距3 mm，如图9.7所示。
打孔后用琼脂写字墨水，在琼脂板上端写上日期及编号等。在中央孔加入标准炭疽沉淀原，在外周孔1/2/3/4，各加炭疽沉淀素血清至孔满为止。加盖平皿，待孔中液体吸干后，将平皿倒置以防止水分蒸发；将琼脂板放入铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘中，置15～30℃室温或37℃恒温箱中，24 h后，即可出现较粗的白色明显的沉淀线。
若用琼脂扩散反应诊断传染病，则是往中央孔滴加被检血清1滴（0.025～0.05 mL），在周围孔滴加不同浓度的抗原各一滴，放湿盒中静置于室温下或37℃恒温箱中2～5 d，观察结果。若阳性反应，则在抗原与抗体孔之间出现1～2条或多条白色沉淀线。阴性者，则无此反应。
