支气管肺泡灌洗液涂片染色方法
■（一）瑞—吉复合染色法
1.原理 在细胞学检查中常用瑞—吉复合染料进行染色，该染色剂是酸性染料伊红与碱性染料亚甲蓝的化合物。此种染料分别和胞核及胞质中的碱性和酸性部分等结合，使细胞核及胞质着不同颜色。我们改进了瑞—吉染液配方，使其染色更为快速、简便，细胞染色良好，结构清晰。本书细胞彩色图片多采用此改良染色法。
2.试剂
（1）Ⅰ液——瑞—吉复合染液配制：瑞氏染料5 g、吉氏染料5 g、中性甘油20 ml、1 mol/L NaOH 0.2 ml。在清洁的研钵里充分研磨，倒入盛器，再加入中性甘油300 ml、甲醇3 000 ml，混匀，染色液配好后即可使用。
（2）Ⅱ液——磷酸盐缓冲液（pH 6.4～6.8）配制：磷酸二氢钾（无水）0.3 g和磷酸氢二钠（无水）0.2 g，蒸馏水加至1 000 ml，配好后用磷酸溶液校正至pH 6.4～6.8。
3.染色方法 ① 加瑞—吉染液3～5滴，以覆盖整个涂片为宜，染色约1 min。② 滴加约等量的缓冲液与染液混合，室温下染色1～3 min。可根据涂片的厚薄、细胞数的多少适当调整染色时间。③ 用流水冲去染液，待干燥后镜检。
注意：若使用市售贝索血细胞染色液按说明书操作。
■（二）革兰染色法
1.原理 细菌的等电点较低，pH为2～5，一般情况下带负电荷，易被带正电荷的碱性染料（如亚甲蓝、碱性复红、沙黄、结晶紫）着色。革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。
2.试剂
（1）结晶紫溶液： ① A液：结晶紫2 g，95%乙醇20 ml。② B液：草酸铵0.8 g，蒸馏水80 ml。需在用前24 h将A液、B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。
（2）碘液：碘1 g，碘化钾2 g，蒸馏水300 ml。将碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升蒸馏水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解，最后补足水量。也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300 ml。
（3）脱色液：95%乙醇。
（4）复染液：① 贮存液：沙黄2.5 g，95%乙醇100 ml。② 应用液：贮存液10 ml，蒸馏水90 ml。
3.染色方法 ① 涂片经火焰固定或未固定的干涂片，加结晶紫溶液染1 min，清水冲去染液。② 加碘液染1 min，水洗。③ 加脱色液，不时摇动10～30 s，至无紫色脱落为止，水洗。④ 加复染液，染30 s，水洗，干后镜检。
4.结果判断 革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。
注意：若使用市售贝索革兰染色液时按说明书操作。
■（三）抗酸染色法
1.原理 分枝杆菌等细菌因其含有特殊的脂肪酸，具有抗酸性，染色时与石炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用，因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到染色目的。
2.试剂
（1）石炭酸复红染液：碱性复红乙醇饱和溶液10 ml（碱性复红3 g加95%乙醇至100 ml），5%石炭酸溶液90 ml。
（2）脱色剂：浓盐酸3 ml，95%乙醇97 ml。
（3）复染液：亚甲蓝乙醇饱和溶液30 ml（亚甲蓝3 g，加95%乙醇至100 ml），10% KOH 0.1 ml，蒸馏水100 ml。
3.染色方法 ① 将制成的新鲜涂片略加温干燥。② 滴加石炭酸复红染液，布满标本，在火焰上徐徐加热3～4 min，至染液出现蒸汽为宜，切不可沸腾。③ 放置5 min左右，使涂片冷却，用水洗去上述染液。④ 滴加脱色剂，约2～3 min，使红色褪尽，然后流水冲洗。⑤ 滴加复染液染半分钟，流水洗，干后在油镜下观察。
4.结果判断 结核杆菌呈红色杆状，各种细胞均染为蓝色。
注意：若使用市售贝索抗酸染色液时按说明书操作。
■（四）墨汁染色法
1.原理 在黑色墨水的背景下可清晰观察到细菌周围环绕着一圈明亮的区域，即黏多糖荚膜，此法用以观察细菌及真菌的荚膜等。
2.试剂 墨汁。
3.染色方法 ① 取离心沉淀物一滴与一滴墨汁在载玻片上混合。② 用镊子夹好盖玻片覆盖于涂片上，注意先将盖玻片一边接触混合液缓缓斜放下，使其不产生气泡。③ 先以低倍镜找好位置，再在高倍镜下观察有荚膜的细菌、真菌及芽生孢子。
4.结果判断 在黑色背景中，见到菌体周围有透明的荚膜似一晕轮或见到出芽的细菌。
注意：若使用市售贝索墨汁染色液时按说明书操作。
■（五）铁染色法（干片、湿片）
1.原理 细胞内含铁血黄素的铁离子在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁粒的部位。
2.试剂 铁染色液：200 g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份，混匀。
3.染色方法 ① 取新鲜涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液，室温下染色30 min。② 流水冲洗，晾干后镜检。
4.结果判断 观察吞噬细胞内有无染成深蓝色的铁颗粒，并按下述标准分级：—，无铁颗粒；1+，少数铁颗粒，偶见铁小珠；2+，较多的铁颗粒和小珠；3+，很多的铁颗粒、小珠和少数小块；4+，很多的铁颗粒和铁小珠，并有很多密集成片和小块。(https://www.daowen.com)
注意：若使用市售贝索铁染色液时按说明书操作。
■（六）过氧化物酶（POX）染色法
1.原理 细胞所含的POX主要为髓过氧化物酶，POX能将二氨基联苯胺的氢原子转移给过氧化氢，产生有色染料沉淀于胞质酶活性处。
2.试剂
（1）甲醛—丙酮缓冲液（pH 6.6）：磷酸氢二钠20 mg、磷酸二氢钾100 mg、蒸馏水30 ml、丙酮45 ml、400 g/L甲醛溶液25 ml，配制后4℃保存。
（2）50 mmol/L Tris—HCl缓冲液（pH 7.6）：3， 3′—二氨基联苯胺20 mg、Tris—HCl缓冲液50 ml、3%过氧化氢溶液0.2 ml，振荡混合后过滤。
3.染色方法 ① 新鲜涂片用冷甲醛—丙酮缓冲液固定30 s（4℃），流水冲洗。② 入基质液温育10～15 min（20℃±5℃），流水冲洗2 min。③ Giemsa染液复染20 min，流水冲洗，晾干，镜检。
4.结果判断 阳性产物为棕黄色颗粒。阳性强度参考标准：—，胞质中无阳性颗粒；±，胞质中有细小阳性颗粒；1+，胞质中阳性颗粒较粗大，常呈局限性分布；2+，阳性颗粒粗大、密集，约占胞质的1/2～2/3；3+，阳性颗粒粗大，几乎布满胞质；4+，阳性颗粒呈团块状，充满胞质，可覆盖核上。
注意：若使用市售贝索过氧化物酶染色液时按说明书操作。
■（七）糖原（PAS）染色法
1.原理 细胞内的糖类可用过碘酸Schiff染色显示，含有乙二醇基的糖类在过碘酸氧化作用下产生双醛基，后者与Schiff试剂作用使无色品红变为紫红色染料沉积，定位于含有多糖成分的部位。在过碘酸氧化前，用麦芽糖淀粉酶或唾液淀粉酶处理标本后行PAS染色，可鉴别是糖原还是其他多糖类物质，如被消化则是糖原。
2.试剂
（1）固定液：95%乙醇，10 g/L过碘酸溶液。
（2）Schiff 试剂：碱性品红1 g溶于200 ml煮沸的蒸馏水中，摇匀5 min，冷却至60℃时加入1 mol/L盐酸40 ml，冷却至25℃时置于棕色瓶内，再加入偏重亚硫酸钠2 g，避光过夜后加入1 g活性炭，吸附过滤后为无色透明液体，保存于4℃冰箱。
（3）复染液：20 g/L甲基绿溶液。
3.染色方法 ① 涂片固定液固定10 min后流水冲洗，晾干。② 浸入过碘酸溶液氧化10 min后流水冲洗，晾干。③ 置于Schiff试剂作用1 h后流水冲洗。④ 复染液复染10 min后流水冲洗，晾干。
4.结果判断 胞质中出现红色或紫红色颗粒、块状或弥散者为阳性。阳性强度参考标准：—，胞质中无色，无颗粒；1+，胞质淡红色，或少量红色颗粒；2+，胞质红色，或10个以上红色颗粒；3+，胞质染红色，或有粗大颗粒，可出现红色块状；4+，胞质紫红色或有粗大块状。
注意：若使用市售贝索糖原染色液时按说明书操作。
■（八）环六亚甲基四胺银染色法
试剂品牌：贝索染液。
1.原理 组织经高碘酸氧化后，组织基底膜或霉菌、肺孢子菌等微生物壁内的黏多糖暴露出醛基，醛基将六胺银还原为黑色的金属银。
2.试剂 高碘酸溶液、硼砂溶液、六亚甲基四胺银粉剂、硫代硫酸钠溶液、伊红染液。
3.染色方法
（1）六胺银工作液配制：吸取50 ml硼砂溶液入六亚甲基四胺银粉剂瓶内，用力摇匀2 min，再将六亚甲基四胺银溶液倒入硼砂溶液瓶内，重复此步骤3次，确保六亚甲基四胺银粉剂充分溶解。最后倒入洁净的玻璃染缸内备用（肉眼可见少许透明状或黑色颗粒属正常现象，勿过滤）。
（2）将干燥后的标本涂片放入高碘酸溶液中氧化10～15 min，流水冲洗6遍。将准备好的六胺银工作液放在62℃水浴箱预热约5 min。
（3）涂片放入预热至62℃的六胺银工作液中恒温作用35～40 min（确保水浴箱内的水高度不低于染缸高度的2/3），直至涂片在黄棕色背景下看到黑色反应，取出涂片，蒸馏水冲洗后镜下检查，若着色不够深可用蒸馏水冲洗后再放回六胺银工作液中继续作用。
（4）流水冲洗。硫代硫酸钠处理3 min，流水冲洗。伊红染液复染30～60 s，流水冲洗。自然干燥后镜检。
注意事项：① 每次染色均以念珠菌为对照。② 低倍镜下看见黑色或褐色片状结构后再转换油镜证实。
4.结果判断 囊壁浓染呈黑色为阳性，背景为橘黄、橘红色。
环六亚甲基四胺银染色是检查包囊的最好方法。染色后在油镜下观察，包囊呈圆形、椭圆形，囊壁染成褐色或黑色，多呈塌陷形空壳或乒乓球样外观。若囊内小体溢出空囊形成括弧样结构是囊壁局限性增厚形成的，这是肺孢子菌（PC）特征性的标志，具有诊断价值。囊内容物不着色。由于括弧样结构只出现在部分包囊，当感染度低时以此标志作为判断标准，易导致漏检。标本经六亚甲基四胺银染色后部分包囊形态不规则，可能是由于染色过程中加温导致菌体变形，或其他原因。因此，建议用恒温电热板进行加热，比在酒精灯上加热容易控制温度与时间。六胺银染色的不足之处是操作复杂且费时。瑞—吉染色简便快速，可以鉴定肺孢子菌滋养体和包囊，滋养体十分明显，但包囊不及六胺银染色清晰，两种染色方法同时检测可提高阳性检出率。
■（九）乳糜试验
1.原理 脂肪可溶解于乙醚中，而脂肪小滴可通过染色识别。
2.试剂 ① 乙醚（AR）。② 苏丹Ⅲ醋酸乙醇染色液：5%乙醇10 ml、冰醋酸90 ml、苏丹Ⅲ粉末一勺（3～5 g，使溶液呈过饱和状态），先将乙醇与冰醋酸混合后再倾入苏丹Ⅲ粉末，使之充分溶解。
3.染色方法 ① 将BALF混匀，取BALF 3～5 ml加入乙醚2～3 ml，混合振摇后使脂肪溶于乙醚。静置数分钟后2 000 r/min离心5 min。② 吸取乙醚与BALF的界面层涂片，加苏丹Ⅲ醋酸乙醇染色液1～2滴。③ 镜检观察是否有红色脂肪小滴。
4.结果判断 镜检涂片：脂肪滴呈红色。乳糜BALF：加乙醚后而澄清。
注意：BALF沉渣涂片直接加入苏丹Ⅲ醋酸乙醇染色液可鉴定吞噬脂肪滴的巨噬细胞，巨噬细胞胞质呈橘黄色或橘红色时为阳性，不着色时为阴性。