支气管肺泡灌洗液常规细胞学检查操作规程
BALF是通过纤维支气管镜对支气管以下肺段、亚肺段水平用无菌生理盐水反复灌洗，回收获取的肺泡表面衬液样本。BALF的细胞形态学、病原学、免疫学及分子生物学等一系列检查在呼吸系统疾病，尤其是下呼吸道疾病的诊断、疗效观察、预后判断及发病机制研究等方面有着重要的意义。本规程主要对BALF常规细胞学检查操作进行规范。
■（一）检验目的
计数支气管肺泡灌洗液中细胞数量（红细胞、有核细胞）及各类有核细胞所占百分比，同时观察并准确识别BALF中各类细胞（包括血液细胞、肿瘤细胞）、寄生虫、结晶，发现细菌或真菌及其他有形成分，为临床对疾病的诊断、鉴别诊断、治疗效果和预后评估提供检验诊断依据。
■（二）标本采集
1.患者采集前准备 同纤维支气管镜检查术前准备，由临床医生实施，在纤维支气管镜气道检查后，于活检、刷检前做BAL并回收BALF。肺泡灌洗液应首先排除禁忌证，并向患者或其授权委托人说明此检验的必要性，以及肺泡灌洗液获得的方法、可能发生的并发症等，得到其理解及同意后方可进行肺泡灌洗（详见本书第一章）。
2.标本采集
（1）灌洗部位选择：弥漫性肺部病变者选择右肺中叶（B4或B5）或左肺上叶舌段，局限性肺部病变患者选择相应支气管肺段进行灌洗。
（2）BAL操作步骤（由临床医师操作）
1）灌洗：① 成人BAL操作步骤：将纤维支气管镜顶端紧密楔入段或亚段支气管开口处，再经活检孔通过硅胶管快速注入37℃灭菌生理盐水。通常每次25～50 ml，总量100～250 ml，一般不超过300 ml。肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗液病原体检测中国专家共识（2017年版）认为，用于诊断性BAL，采用60～120 ml的灌洗剂量，且分次灌洗，是比较好的方法。灌洗量的多少可影响标本检测的结果，包括细胞比例、蛋白质含量等。② 儿童BAL操作步骤：将支气管镜嵌顿于靶支气管后，经支气管镜工作孔道先后注入37℃灭菌生理盐水（每次1 ml/kg，≤20 ml/次，总量≤5～10 ml/kg）灌洗，或采用灌注总量为1～3 ml/kg，分3次灌洗；体重＞20 kg的年长儿童可同成人一样灌洗，亦可适当调整灌洗量。
2）负压吸引：立即用50～100 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）负压吸引回收灌洗液，通常回收率为40%～60%，至少应≥30%。海军军医大学第一附属医院纤维支气管镜检查中心对采集的BALF记录其总量及灌洗部位，通常不进行过滤处理。
3）BALF收集：根据检测目的分装于不同的无菌试管或洁净试管中。用于病原学分析的标本需用无菌容器收集。常规细胞学分析需选择硅化的塑料容器或洁净玻璃容器以减少细胞的黏附，送检标本量应不少于10 ml，儿童送检标本量应不少于3 ml。如考虑为大气道疾病时建议第一管回吸收液单独处理，非大气道疾病时可将所有标本混合后分装送检。贴好标本信息标签，应在室温2 h内送至实验室。
4）合格的BALF标本：① 回收率＞40%。若选择下叶或其他肺叶肺段灌洗回收率≥30%。② 不可混入血液，红细胞应＜10%，上皮细胞应＜5%。③ 多部位灌洗时注明灌洗部位，并注明灌洗液或冲洗液。④ 严格按相应标准的要求采集儿童支气管肺泡灌洗液标本。
■（三）标本接收与处理
标本送达检验科后由工作人员在Lis系统扫码登记接收，对标识不明、采集量不足等不合格的标本，执行标本拒收程序。接收标本后应及时检验，室温可保存4 h；分析后的标本保存24 h，不建议将标本保存24 h后再应用于检测分析。
对于部分不合格标本可执行让步接收与让步检验，与临床进行沟通，并在报告单中备注，说明标本状况对检验结果的影响。
■（四）检验程序步骤
1.标本预处理 收到标本后及时处理，观察灌洗液性状，如标本含有大量黏液，加入2倍体积的0.1% DTT试剂（二硫苏糖醇），置于恒温摇床，300 r/min，37℃处理30 min～1 h。如没有配置恒温摇床，加入0.1% DTT试剂后置于37℃水浴箱，每隔10 min充分颠倒混匀，避免用力振荡，处理时间30 min～1 h。其他去除BALF黏液的试剂按照试剂说明书操作。
2.理学检查及细胞计数
（1）理学检查：外观透明度正常为无色透明样液体。BALF呈血性或棕褐色则提示急性弥漫性肺泡出血；BALF外观呈乳白色或淘米水样，放置15～20 min后可见絮状颗粒物沉淀则高度提示为肺泡蛋白沉积症。
（2）细胞计数：参照中华人民共和国卫生行业标准临床体液检验技术要求（WS/T 662—2020），结合工作实践施行。
1）将预处理后的BALF标本混匀，取5～10 μl标本充入改良的Neubauer计数板的计数池中，静置2 min后计数BALF中的细胞总数及有核细胞数；计数结果乘以预处理稀释倍数，以**×106/L单位报告。
2）BALF未经纱布过滤或0.1% DDT预处理的标本，尽量将标本混匀，取无黏液标本充入改良的Neubauer计数板的计数池中，静置2 min后计数BALF中的细胞总数及有核细胞数，以**×106/L单位报告。在细胞计数的同时，应注意标本中未染色的有形成分形态如寄生虫及虫卵等。
3）若采用自动化分析仪体液模式分析，严格按照仪器操作说明书作业。BALF必须严格预处理方可进行体液模式检查分析，避免进样孔堵塞。
3.标本离心 离心的目的是将BALF中的有形成分进行浓缩，离心速度800～1 500 r/min，离心时间5～10 min，取出标本用一次性吸管去除上清液，留底部沉淀物约50 μl用于制片。
4.制片 制片分为手工法和仪器法。
（1）手工法制片：常用的制片方法有推片法、涂抹法、压拉法。根据标本性状合理选择制片方法，首选推片法。肺孢子菌、局灶性嗜酸性粒细胞增多常分布于黏液絮状物中，采用推片法+压拉法，或推片法+涂抹法等多种方法制片，可提高阳性检出率。
1）推片法：适用于沉淀黏液较少或经过预处理的标本，标本离心后留沉淀物约50 μl，混匀后取5～10 μl置于载玻片的右侧端，推片与载玻片成30°～45°夹角，注意推片速度，使涂片分为头、体、尾三部分。为了提高异常细胞的检出率，需制备无尾厚片两张。注意癌细胞体积较大，常位于细胞涂膜的尾部，因此推片时不要将尾部推出片外。制作涂片4～6张。
2）涂抹法：适用于有黏液絮状物的标本，标本不易离心沉淀。用长度约12 cm的洁净小棒将标本均匀涂抹于载玻片上，涂片动作应轻柔利索，同方向涂抹，不要反向涂抹。制作涂片4～6张。
3）压拉法：适用于有黏液絮状物的标本，标本不易离心沉淀。选少许黏液絮状物，置于一张载玻片上，取另一张载玻片盖于标本之上，稍加压力均匀压开后，反向水平拉开，即成两张厚薄均匀的涂片。制作涂片4～6张。
注意：同一管离心标本同时采用悬浮絮状物制片和沉淀物制片。若遇到黏液絮状物不能沉淀的标本，可先将离心后标本仍悬浮于灌洗液上面的黏液絮状物取出，置于载玻片上，采用压拉法或涂抹法制片，再去除上清液取沉淀物用推片法制片。
（2）仪器法制片：采用细胞离心机（Cytospin）甩片，按仪器操作说明书规范操作。应用此方法制片，细胞分布均匀，结构清晰，利于形态辨识，可提高病变成分检出率。若标本有核细胞数显著增高时使用生理盐水适当稀释标本，通常将有核细胞数稀释至（100～200）×106/L为宜，有的标本稀释可达10～200倍。血性标本应溶解红细胞后稀释。
制片时在玻片上标记患者唯一标识信息，制片结束平放在桌面上自然干燥后染色。
5.涂片染色 常用的染色方法有瑞—吉染色法或瑞氏染色法、革兰染色法、抗酸染色法、墨汁染色法、铁染色法及其他染色法等。BALF常规细胞学涂片染色首选瑞—吉染色法，根据需要加选其他染色，如瑞—吉染色涂片检出大量含铁血黄素细胞，应加选铁染色予以确证，并记录其占巨噬细胞的百分比。本室自配瑞—吉染液染色操作方法：涂片滴加瑞—吉染液3～5滴，覆盖整个涂片，染色约1 min；滴加等量缓冲液与染液充分混匀，染色1～3 min；流水冲去染液，待涂片干燥后镜检。
6.阅片及细胞分类 BALF镜检阅片包括湿片直接镜检阅片和涂片染色镜检阅片，两者兼用可以提高阳性检出率。应正确识别：成熟红细胞、有核红细胞；中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞；淋巴细胞、反应性淋巴细胞、浆细胞；单核—巨噬细胞；恶性肿瘤细胞（原始细胞、淋巴瘤细胞、非造血系统肿瘤细胞等）；噬菌细胞；细菌、真菌、寄生虫（卵）及结晶等。
（1）沉淀物湿片直接镜检：对于未染色标本采用直接镜检法，将离心后的沉淀物混匀，取混匀标本10～20 μl滴于载玻片上，盖上盖玻片，避免气泡，观察镜下有形成分，包括异常的大细胞、活体的纤毛柱状上皮细胞、寄生虫（原虫）及虫卵、结晶等。注意不要把活体的纤毛摆动的柱状上皮细胞误认为蠊缨滴虫。
（2）涂片染色镜检：对于染色后的涂片，首先低倍镜观察全片，尤其在尾部观察有无成团、成片或体积较大的异常细胞，有则转至油镜下观察细胞结构，鉴定细胞性质；然后选择细胞分布均匀的部位进行分类200个有核细胞，主要是巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等，分类结果以百分比报告。对于异常细胞需进行形态及数量描述。阅片时应采用多部位阅片，兼顾片头体积较小细胞和片尾大细胞，注意病原微生物及其他有意义的有形成分。
涂片细胞分类时，镜下若鳞状上皮细胞占有核细胞的比例＞5%，提示标本被上呼吸道分泌物污染；纤毛柱状上皮细胞＞5%时，提示BALF并非完全来自远端气腔，不能代表肺泡灌洗液成分。当纤毛柱状上皮/鳞状上皮细胞＞5%时，建议将此类细胞除外进行细胞计数分类，控制标本不合格的干扰因素，保证检验质量，满足临床需求。
■（五）报告
1.报告名称及模式
（1）报告名称：为支气管肺泡灌洗液（BALF）常规细胞形态学检查检验诊断报告，简称为BALF常规细胞学报告。
（2）报告模式：依据法规，其模式为数值/数字、描述、解释、意见、建议、预测、模拟、模型等。
2.报告内容 BALF常规细胞学报告由常规和细胞学两部分内容组成，包括BALF性状、有核细胞计数及细胞分类、细胞学分析、病原微生物、寄生虫及其他有价值的信息。
3.BALF常规报告 颜色、透明度、细胞总数、有核细胞计数、细胞分类计数百分比，同时报告异常成分，如噬菌细胞、真菌、包涵体、寄生虫及结晶等。
4.BALF细胞学报告 采用分级报告，未查见恶性细胞、查见核异质细胞、查见可疑恶性细胞、查见恶性细胞。如果能够确定上皮源恶性细胞则报告癌细胞；如果能够确定是造血淋巴组织恶性细胞则报告为白血病细胞、淋巴瘤细胞；如果不能确定来源时一律报告恶性细胞。
5.图文报告 有条件的单位推荐出具BALF常规细胞学检查图文报告，包括有核细胞计数及细胞分类、图像和形态学描述、解释和建议等。(https://www.daowen.com)
（1）图像：用图像采集系统在镜下选择涂片细胞分布均匀、染色良好的部位，对诊断有价值的细胞进行拍摄，选择有代表性的图片用以图文报告。
（2）形态学描述：对肿瘤细胞进行必要的形态描述，包括细胞分布、细胞大小、胞质量、胞质着色、胞质内容物、核大小、核形、核染色质排列、核仁数量与大小等。对其他异常细胞形态也需进行形态学描述，如中性粒细胞或巨噬细胞吞噬细菌现象等。
6.让步检验报告 在保证检验质量的前提下，对纤毛柱状上皮细胞或鳞状上皮细胞＞5%的标本执行让步检验，细胞分类时不应将此类上皮细胞计入有核细胞百分比，以半定量形式表 示（5%～10%为“+”，11%～20%为“++”，21%～30%为“+++”，＞30%为“++++”），同时可在报告中注明“取材不佳、上皮细胞明显增多”。对于有核细胞分布不均匀的涂片报告时应选择具有对诊断疾病有价值的阳性指标，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞增高等，并注明“局灶性分布”。
7.主动并及时报告 检出具有特殊意义的成分及其他可能影响临床诊疗活动的重要发现如肺孢子菌、隐球菌、恶性肿瘤细胞等，应及时报告临床。
■（六）涂片保存
阅片发出报告后，对涂片进行分类归档并妥善保管，保存时限按各实验室标准操作规程进行处置，一般保存3～5年。
■（七）生物参考区间
见表2—1。
表2—1·生物参考区间
■（八）干扰因素及变异的潜在来源
细胞溶解或纤维支气管镜检查致出血等，阅片者主观经验差异。
■（九）结果计算及测量不准确度
无。
■（十）患者检验结果可报告区间
无。
■（十一）安全性预警措施
（1）肺泡灌洗液标本的运送必须保证运送过程中的生物安全，防止溢出。肺泡灌洗液标本溢出后，应该立即对污染的环境和设备进行消毒处理。
（2）对表明有传染性疾病的肺泡灌洗液标本应特别防护，以不污染环境或保护工作安全为前提。
（3）在进行肺泡灌洗液分析的一切操作活动中应按实验室安全管理程序执行。进行操作前，首先应采取必要的保护性措施如穿戴保护性外套、口罩及手套等，特殊情况时采用三级防护。
（4）与肺泡灌洗液标本接触的一切器皿、仪器组装/拆卸组合零件都应视为污染源，如果操作人员不小心接触了这种污染源，应立即用清水冲洗被污染区域，进行消毒处理。
（5）如果操作人员的皮肤或衣物上沾到了肺泡灌洗液及废液，应立刻用清水冲洗并进行消毒处理。如果眼睛被溅入肺泡灌洗液及废液，应用大量的清水冲洗并采取必要的医疗措施。
（6）所有检查过的肺泡灌洗液标本及有关的废弃物都会带来潜在的危险或生物污染，所有废弃样本及废弃物的处理方法同肺泡灌洗液标本的处理程序，依照相关生物安全法规执行。
■（十二）临床意义
BALF常规细胞学检查主要应用于肺部感染、肿瘤、间质性肺病的诊断与鉴别诊断、疗效监测及预后评估。
（1）淋巴细胞计数＞15%、中性粒细胞＞3%、嗜酸性粒细胞＞1%，或肥大细胞＞0.5%，则分别称为BALF淋巴细胞增多型（即淋巴细胞为主型）、中性粒细胞增多型（即中性粒细胞为主型）、嗜酸性粒细胞增多型（即嗜酸性粒细胞为主型）和肥大细胞增多型（即肥大细胞为主型）。
（2）淋巴细胞计数≥25%，则提示肉芽肿性肺病，如结节病和过敏性肺泡炎（HP）、非特异性间质性肺炎（NSIP）、慢性铍尘肺、药物反应、淋巴细胞性间质性肺炎（LIP）、隐源性机化性肺炎（COP）。
（3）淋巴细胞计数＞50%，则提示HP或富细胞型NSIP。
（4）嗜酸性粒细胞计数≥25%，若临床表现符合则可诊断嗜酸性粒细胞性肺病。
（5）中性粒细胞计数≥50%强烈提示急性肺损伤、吸入性肺炎或化脓性感染。
（6）肥大细胞计数＞1%，同时淋巴细胞计数＞50%及中性粒细胞计数＞3%则提示HP。
（7）细胞分类以含铁血黄素细胞为主，则提示慢性或隐匿性肺泡出血性疾病，如肺含铁血黄素沉着症或弥漫性肺泡损伤、肺出血—肾炎综合征（goodpasture’s syndrome）等。
（8）细胞分类以吸烟相关的巨噬细胞（尘细胞）为主，其他细胞计数正常或轻度异常，则提示吸烟相关的ILD，如脱屑性间质性肺炎（DIP）、呼吸性细支气管炎伴间质性肺病（RB—ILD）或朗格汉斯细胞组织细胞增生症（PLCH）等。
（9）检出噬菌细胞及大量纯种细菌，则提示细菌性肺部感染。
（10）检出肺孢子菌，则强烈提示肺孢子菌肺炎。
（11）检出真菌及菌丝，则提示真菌性肺部感染。若检出组织胞质菌，则提示组织胞质菌肺病。偶见真菌孢子报告时要慎重，予以说明。
（12）检出包涵体、合胞体，则提示病毒感染性肺病。
（13）检出寄生虫或虫卵，则提示寄生虫感染性肺病。
（14）检出大量无定形碎片颗粒，则强烈提示肺泡蛋白沉积症。
（15）检出石棉小体，则提示尘肺。
（16）检出吞噬透明折光性强的碎玻璃样金属颗粒巨噬细胞（尘细胞），则提示硬金属肺病。
（17）支气管—胆管瘘患者的BALF中可检出胆红素结晶。
（18）检出癌细胞，则提示原发性肺癌或转移性肺癌。
（19）检出造血淋巴组织系统原始细胞、淋巴瘤细胞，则提示白血病、淋巴瘤。