五、 内容

推荐所有含腺癌成分的晚期非小细胞癌患者，应在组织病理学诊断的同时常规进行EGFR/ALK/ROS1基因检测，对于不吸烟的鳞癌患者也需要进行EGFR/ALK/ROS1基因检测。

（1）EGFR基因：EGFR基因常见的敏感突变（如19外显子缺失突变，21外显子p.L858R点突变）与EGFR TKI治疗有效相关；近期数据提示没有敏感EGFR突变的肿瘤不宜采用EGFR TKI治疗。约有10%的EGFR突变型NSCLC为少见突变（如19外显子插入，p.L861Q，p.G719X，p.S768I），同样认为对EGFR TKI治疗有效。部分EGFR突变对EGFR TKI治疗无效（如20外显子插入突变和p.T790M）。大部分EGFR 20外显子插入突变提示临床TKI治疗耐药。但少见的EGFR 20外显子插入突变（p.A763_Y764insFQEA）仍对EGFR TKI治疗有效，因此需要明确20外显子插入突变具体突变点位。p.T790M大部分发生在初始EGFR TKI治疗后复发病例，是已知的EGFR TKI耐药机制。胚系p.T790M与家族性肺癌倾向有关，因此如果TKI治疗前检测到p.T790M突变，需要咨询肿瘤专家，并做进一步检测。EGFR敏感突变患者在EGFR—TKI治疗过程中至少需要高灵敏度的T790M的检测；如果没有p.T790M突变，其他耐药机制（MET扩增、HER—2扩增）检测也有助于指导下一步治疗。出现p.T790M突变时可考虑使用第三代TKI药物。p.T790M的检测方法至少应有5%突变丰度的检测灵敏度。初始敏感基因突变作为内对照，以确定p.T790M是否为亚克隆突变。

目前有很多EGFR基因突变检测的方法，包括直接测序法、基于实时（real-time）PCR基础上的方法如突变扩增阻滞系统（amplification refractory mutation system，ARMS）、二代测序等。这些方法由于其特异性及敏感性方面的差异，各有优势和劣势。不推荐使用EGFR突变特异性抗体，只有当组织非常有限时方可考虑使用［10］。

（2）ALK基因：肺癌中，ALK基因变异主要为ALK基因发生重排，与其他基因融合，形成ALK融合基因。最常见的ALK基因融合变异为2号染色体短臂倒位［inv（2）（p21p23）］，形成EML4（棘皮动物微管相关蛋白样4）—ALK融合基因，约占所有NSCC的5%。针对ALK融合基因检测可以在多个分子水平上进行，包括荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）在DNA水平上检测ALK基因易位；反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT—PCR）检测ALK融合mRNA；免疫组化检测ALK融合蛋白表达，以及二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）检测DNA水平上的易位序列或mRNA水平上的融合序列。目前，我国NMPA批准了四个技术平台的ALK基因检测伴随诊断试剂，包括ALK IHC—Ventana D5F3、FISH、RT—PCR、NGS检测平台。ALK IHC—Ventana D5F3阳性判读标准为肿瘤细胞胞质中存在强颗粒状染色（任何阳性肿瘤细胞的百分比），已知的假阳性染色要排除，包括肺泡巨噬细胞胞质内斑点、神经源性细胞（神经和神经节细胞）、腺上皮细胞染色、正常黏膜组织和坏死肿瘤组织有时也能见到染色颗粒。研究结果显示，这四个技术平台检测试剂均具有较高的敏感性及特异性，但各种方法各有其优缺点，可以根据样本特点和患者经济等情况选取相应检测方法。

（3）ROS1基因：融合基因在NSCC中的阳性率为1.0%～3.4%，目前发现ROS1基因重排主要发生的组织类型为腺癌。ROS1基因位于6q22.1，多个伴侣基因均可与ROS1发生重排从而激活基因，常见的有CD47、SLC34A2、CCDC6和FIG，对口服ROS1—TKI药物有效。目前针对ROS1融合基因的常用方法有荧光原位杂交（FISH）、荧光定量PCR技术（RT—PCR）、免疫组织化学法和NGS方法。各种方法各有其优缺点。FISH方法为NCCN指南推荐的检测ROS1融合基因的检测方法，但价格昂贵，操作规范要求较高，目前还没有一家公司的FISH获得FDA的批准；RT—PCR对标本质量要求较高，需专用的试剂盒进行检测，目前国内已有多个试剂盒获CFDA批准；免疫组化简便易行，但阳性标准不统一，有一定的假阳性，目前不推荐临床检测使用。

（4）BRAF基因：BRAF V600E突变在NSCC中的突变率约为2%，其中大部分是腺癌；与黑色素瘤中BRAF突变80%以上为V600E 突变不同，NSCC中BRAF突变半数为非V600E突变。BRAF的p.V600E突变的NSCC对联合应用BRAF和MEK口服抑制剂有效。(https://www.daowen.com)

（5）KRAS基因：KRAS基因突变也是非小细胞癌的驱动基因。RAS基因被激活最常见的方式就是点突变，多发生在N端12、13和61密码子，其中又以12和13密码子突变最常见，突变病例预后较无突变者差，突变可导致EGFR—TKI耐药。

（6）MET基因：在NSCC中，MET激活途径多样，包括基因突变和扩增等，通过多种机制。MET基因拷贝数增加有多倍体和扩增两种方式，也是EGFR—TKIs耐药的主要机制之一。FISH方法检测MET/CEP7值，可区分多倍体和扩增。NGS可用于扩增检测，需要与正常二倍体比较。基因拷贝数达到多少为MET扩增阳性还没有形成共识。目前的做法是按照MET/CEP7比值，分为低水平扩增（≥1.8，＜2.2）、中等水平扩增（＞2.2，＜5）和高水平扩增（≥5）。约4%的肺腺癌病例因MET基因DNA水平第14外显子剪接区域（splice sites）的点突变或缺失导致MET第14外显子mRNA水平出现部分或完全跳跃缺失（MET exon 14—skipped）。MET 14号外显子跳跃突变的检测包括基于PCR的方法和NGS方法，在目前临床实践中最常用的是NGS方法。基于RNA 的NGS在检测14号外显子跳突的敏感性比基于DNA的NGS更高。

RET基因重排是在肺腺癌中比较少见的一个驱动基因突变。RET基因常见的融合伴侣包括KIF5B、CCDC6及NCOA4基因等。目前针对RET融合基因的常用方法有荧光原位杂交（FISH）、荧光定量PCR技术（RT—PCR）和NGS方法。

（7）HER2基因：HER2基因扩增是NSCC患者EGFR—TKI耐药机制之一，HER2外显子20突变是NSCC中比较少见的驱动基因突变。

（8）PD—L1：通过免疫组化检测PD—L1的表达水平是目前判断NSCC患者是否适合使用免疫检查点抑制剂治疗以及能否从治疗中得到获益的主要评估手段。因在检测过程中存在多个亟待解决的问题，PD—L1检测仍然面临诸多挑战，如不同单抗和IHC染色平台的使用、PD—L1染色阳性截断值的设定、待评估的细胞类型（肿瘤细胞或免疫细胞）、肿瘤的异质性和组织样本采集的时间等，这些因素均会对结果的判读造成影响。目前FDA已批准5种标准化的商用PD—L1检测试剂盒用于临床检测，包括配套Dako平台的PD—L1 IHC 28—8 pharmDx、22C3 pharmDx、73—10 试剂盒以及配套Ventana检测平台的PD—L1 IHCSP142和SP263试剂盒。PD—L1 IHC 22C3 pharmDx蛋白表达应用TPS（Tumor Proportion Score）来定义，即呈现部分或完整细胞膜染色的肿瘤细胞占所有肿瘤细胞的百分率。如果TPS≥50%，即为PD—L1高表达，也就意味着适合单独用药。SP142除了继续沿用针对TC表达进行评判，也加入了对于IC的评判，是唯一对肿瘤细胞和浸润的淋巴细胞均加以考虑的检测试剂，PD—L1表达状况定义为任何强度PD—L1阳性的浸润免疫细胞（IC）所占据的肿瘤细胞面积的百分比，肿瘤细胞上的PD—L1表达不参与评分。评估基于PD—L1任何强度表达的肿瘤浸润性免疫细胞占肿瘤面积的比例（%IC）或PD—L1任何强度表达在肿瘤细胞中的比例（% TC）。NSCC组织中大于或等于50% TC或大于或等于10% IC有PD—L1表达可能与TECENTRIQ（atezolizumab）提高总生存率相关。SP263和28—8试剂盒的判读只需要关注肿瘤细胞的染色情况。在四种检测方法中，28—8、22C3和SP263在肿瘤染色方面一致性较好；在四种方法中，免疫细胞上PD—L1的表达较之肿瘤细胞上的表达差异性更大。