电子显微镜生物样品的制备
细胞或组织中含有的水分会阻碍超薄切片的制备，需要将样品制备成包埋块，使细胞、组织具有一定的切割性，便于超薄切片的制备。电子显微镜样本的制备涉及取材、固定、脱水、浸透、包埋等步骤。
（一）取材和固定
1.取材
取材是电镜样本制备的第一步，取材方法是否得当直接关系切片质量。对于任何活组织，包括活检组织和细胞等，取材需做到：
（1）快：取材操作必须快速以尽量保持细胞的生活状态，若为实验动物应力争在动物心脏停止搏动后的0.5min到1～2min内取材完毕，若为活检组织取材，也应尽快取下材料。将取出的材料立即浸入固定液内。取材最长时间不应超过15min。
（2）小：一般要求取出的组织大小应在0.5～1mm3之内，一般不允许大于1mm3，否则影响切片质量。
（3）准：如实验动物同一器官的取材部位不一致，就会得到不同的实验结果，故取材部位应准确可靠。
（4）低温操作：取材操作要在4℃左右的低温条件下进行，特别是制作组织化学和细胞化学用样品时要注意低温条件。
（5）避免损伤：细胞对取材的机械性刺激所引起的应激反应，有时难以与病理反应相鉴别，甚至造成错误诊断。
（6）做好标记。
2.固定
固定是制备电镜生物样品最重要的环节。固定的方法有2种：物理方法和化学方法。化学方法是目前超薄切片技术中常用的方法，即用一定的化学试剂来固定细胞的结构，这些化学试剂称为“固定剂”。固定剂的作用在于使形成细胞“骨架”的蛋白质膜的网状结构中网格间的流动蛋白质凝固，以保存各种细胞器的空间联系。固定剂还可以使细胞中的所有其他化学成分如核酸、核蛋白、糖类和脂类等变为不可溶解，使之像它们固定开始的那一瞬间一样保持生活时的状态和位置，从而把精细的形态结构保存下来。
理想的固定剂应该具备的条件是：
（1）穿透力强：能穿过细胞外的结缔组织和细胞质膜，迅速而均匀地渗入细胞内，并尽可能立即扩散到整个细胞质和核质中。
（2）凝胶作用好：能立即使蛋白质凝固而杀死细胞，以尽量减少“死后变化”。
（3）能稳定细胞的各种结构成分，以保证在固定之后的各种样品制备程序中不致溶解或丢失。
（4）能保持一定的酶活力，以供细胞化学测定。
（5）对细胞没有收缩或膨胀作用，以保持各种结构处在生活时的形态。
（6）对于组织、细胞的结构成分无伤害作用，不引起人工假象或畸变。
目前还没有一种化学试剂有希望完成固定所要求的全部功能，并符合上述的全部条件。补救的方法是采用多种各具优点的固定剂，进行2～3次的重复固定，使细胞的不同结构成分与各自亲和的固定剂有效地反应，而达到满意的固定效果。目前电镜技术工作中多采用双固定法：第一次固定（或称前固定）使用对组织穿透较快较深的戊二醛；第二次固定（或称后固定）用的是固定作用较全面但穿透力很弱的四氧化锇。
3.漂洗
组织块经前固定以后，应使用配制固定液所用相同系缓冲液充分漂洗，以除去残留的固定液。在双固定时，必须将戊二醛洗净，才能进入四氧化锇。四氧化锇固定后，必须从组织块中充分洗去残留的四氧化锇，以免四氧化锇与脱水剂作用。清洗时间可数分钟、数小时，乃至过夜，期间需更换漂洗液数次。
（二）脱水
生物样品经固定、漂洗后，需彻底除去其中含有的游离水分。乙醇和丙酮是常用的脱水剂，它们既能与水互溶又能和包埋剂互溶。常用的脱水方法为：4℃条件下，使用梯度浓度乙醇将组织中的水分置换出来，具体步骤为：（乙醇浓度）50%→70%→80%→90%→100%（2次），每步10～15min。脱水过程一定要充分，要根据材料的致密程度和块的大小，适当增加或减少脱水时间，原则是脱水完全，时间尽可能地短。如果脱水组织需过夜，可将之置留于70%乙醇或丙酮中。
（三）浸透
组织块脱水后包埋前需进行浸透。目的是使包埋剂逐步浸入组织块中完全取代脱水剂。具体做法是：将样品置于脱水剂与包埋剂的混合物中逐步浸透，脱水剂的比例逐步减少，包埋剂的比例逐步增加，最后浸入纯包埋剂中。
浸透是很重要的步骤，如浸透不充分将给切片造成困难；若浸透时间过长将增加细胞成分被抽提的机会。可根据组织块大小、致密程度、包埋剂黏度调整浸透时间。温度会影响浸透效果，一般纯包埋液的浸透可在37℃烘箱中进行，其他可在室温中进行。
（四）包埋
1.包埋剂
理想的包埋剂应当具备以下特点：
（1）单体的黏度低，能迅速而均匀地渗透到组织细胞内部，对组织没有化学作用；
（2）聚合均匀充分，聚合前后体积变化小，不引起组织结构变形；
（3）聚合后有良好的切割性，能够通过配方的改变而便于调整其软硬度，软硬度易于调整；
（4）切片能耐受电子束轰击，高倍放大时不显示包埋剂本身的任何细微结构；
（5）容易获得，价廉，对人体无毒性作用，使用时操作方便；
（6）能溶于脱水剂；
（7）包埋块的切割性能好，易于切片，制出的切片容易展平。
有多种类型的包埋剂供电镜包埋使用，最常用的是环氧树脂、聚酯树脂。环氧树脂中常用的是国产618树脂、Epon812树脂和Spurr树脂。
2.制备组织包埋块
包埋组织处理的最后步骤是制备组织包埋块，目的是使浸透到组织块内部的包埋剂在一定条件下聚合为包埋块，使细胞、组织获得适当的硬度、韧度和弹性，以能承受切片力的作用，最后能够切出超薄切片。
包埋方法包括常规包埋及定向包埋。常规包埋指包埋前，将所用的包埋器具如胶囊或包埋板预先干燥，否则会影响包埋质量。此外，配制包埋液要混合均匀，充分搅拌，否则包埋块会硬软不均。包埋的具体做法是：先将包埋液注入胶囊，再用牙签从浸透液中将组织块移入胶囊，置于其底部并拨正。也可先将组织块放入胶囊底部，然后注入包埋液。注意：在包埋时，将标签放好，以免病例或实验组别混淆。定向包埋指皮肤、消化管道或呼吸管道的黏膜、骨骼肌等，需定向切片进行观察。取材、修块时即按所需切为长条状或其他可辨认的形状。包埋时可选用较扁平的浅槽模具，注入包埋液后，再将材料定位于其中，待形成聚合块后，进行纵切或横切。
包埋条件为：35℃温箱过夜，45℃24小时，66℃24小时，聚合完毕，将包埋块取出，放入纸袋，于干燥器内保存。
（五）超薄切片技术
1.准备工作
（1）半薄切片
因为电镜观察的区域非常小，为了选取最佳的研究部位或确定超薄切片的切割方向，在进行超薄切片前需制备半薄切片。半薄切片的厚度为0.5～2μm，经染色后在光镜下观察。根据观察结果定位观察对象。例如肾脏超微病理检查，需先用光镜观察半薄切片定位肾小球，根据观察结果进行修块，去掉无关部分，保留需观察的肾小球，再进行超薄切片。此外，根据半薄切片的切面方向取正确的切面以供电镜观察。
制备半薄切片的主要步骤：
①修块及切片：将包埋块固定并置于双筒解剖镜下，用去脂锋利刀片切去顶端树脂；暴露组织，再削去组织块四周的树脂使包埋块顶部呈金字塔形。修块时应尽量保留组织并切去一角作为定位标记，然后切取半薄切片，将之捞至载玻片上，以备染色。
②半薄切片染色：一般先用氢氧化钠的无水乙醇溶液脱树脂，再进行染色。
（2）载网
超薄切片须置于载网上才能放入样品室观察。常用的载网有铜网、镍网，进行细胞化学、免疫电镜细胞化学观察和X 射线元素分析的切片需用不锈钢网、金网、尼龙网、碳网等。通常多用200～300目的载网。大孔载网观察视野大，对切片的遮挡较少，适于低倍、大视野观察，但大孔载网的支持力低；小孔载网支持力好，适于高倍、高分辨率观察。
（3）支持膜
为增加载网的支撑能力，需在载网上铺覆一层支持膜。支持膜为电子透明，厚度2nm左右。支持膜不能太厚或太薄，厚的支持膜对铜网的附着力差，易于脱落，且使超薄切片反差下降；过薄的支持膜虽能提高标本的分辨率，但经电子束轰击时易破裂，影响超薄切片的观察。
2.切片
基本操作步骤是：装块、装刀、对刀、向刀槽注双蒸水、切片。切片时避免震动，保持室内温度恒定。
（1）切片刀的制备(https://www.daowen.com)
目前，用于制备超薄切片的刀有两种：玻璃刀和钻石刀。制备超薄切片最常用的刀是玻璃刀，其优点是取材容易、制备方便，价格低廉；缺点是刀刃不够锋利、比较脆、不耐用、不能切硬质材料。钻石刀坚硬锋利、方便、耐用，对各种硬度的生物材料均能获得质量较好的切片。钻石刀近年来已被许多实验室采用，其缺点是价格昂贵、易损伤。
（2）刀槽
经刀切出的超薄切片漂浮在液体表面，不仅便于收集捞取，还利于切片展平。所以在切片之前，须在刀口一侧做一个小水槽，称之为刀槽。刀槽一般用胶布自制，亦可用市售的金属或塑料刀槽安装。可用融化的石蜡密封接缝处防止漏水，在切片前向刀槽内注入双蒸水。
（3）展片与捞片
因切片很薄，在切片时易发生皱缩，需要将切片展开。展片的方法是用蘸有氯仿或二甲苯的小滤纸片靠近切片，因试剂发出的蒸汽可使皱缩的切片软化伸展，然后用扣网法或牵引法将切片转移到载网上。
（4）切片厚度的判断
切片机上虽然标有切片厚度指示标志，但并非能真正代表切片的实际厚度，所以切片时，判断切片的厚度很重要。一般是利用切片产生的反射光干涉色来判断切片的厚度，它是日光灯下由于切片表面反射光与切片下水面反射光发生干涉，使不同厚度的切片在显微镜下呈现不同的干涉色。干涉色与切片厚度近似值关系如下：
灰色：40～50nm；
银白色：50～70nm；
金黄色：70～90nm；
紫色：90nm以上。
紫色切片太厚，电子束不易穿过；金黄色切片较厚，分辨率比较低，但反差好。一般透射电镜常用的是灰色切片与银白色切片，有较高的分辨率，能获得较满意的观察效果。
（六）染色
未经染色的生物样品超薄切片，在电镜下缺乏反差，无法进行观察。这是由于生物材料的主要成分是碳、氢、氧、氮、硫、磷等元素，它们都是低原子序数元素，散射电子的能力很低，互相差别又小，因而在电镜下反差小，图像不清晰（如图1.1.5-2）。尽管固定用四氧化锇具有轻微的电子染色作用，但仍不够。为了充分显示细胞的微细结构，就要增加超薄切片样品结构对电子的散射能力，提高反差的方法称为“电子染色”。
图1.1.5-2 透射电镜示细胞结构图
理想染色应达到的标准是：
1.有选择地使重金属结合或吸附于样品的一定部位，以增进反差；
2.不因结合或吸附造成样品的人工损伤和污染，不造成细微结构的变形；
3.不使细胞成分抽提和丢失；
4.染色剂不能与固定剂发生不良反应；
5.染液配制简单，染色时间短，操作简易，染色均匀；
6.对电子束照射稳定，在室温和正常大气压情况下稳定。
常用的电子染色剂有醋酸铀、枸橼酸铅。醋酸铀是广泛使用的电子染色剂，它能与细胞内大多数成分结合，可提高核酸、核蛋白和结缔组织纤维成分的反差，也能使糖原、分泌颗粒和溶酶体染色，但对膜结构染色效果差。醋酸铀遇光易分解，应密封避光冷保存。铀具有放射性，应注意保护。枸橼酸铅也是广泛使用的染色剂，它主要的染色作用是与切片中的还原性锇作用，提高膜系结构和脂类的反差，并能显示糖原颗粒。它的缺点是，在染色时极易与空气中的二氧化碳结合形成碳酸铅沉淀而造成切片污染，所以染色时，应注意染液尽量隔绝空气。可在染色用的培养皿内放些结晶氢氧化钠以中和空气中的二氧化碳。由于醋酸铀对细胞结构染色不足，所以一般进行双重染色，先铀染后铅染。于室温下用醋酸铀染色5～30min，切片经双蒸水充分漂洗后，再用枸橼酸铅染3～15min。染色操作可在蜡盘中进行。
（七）带有超薄切片载网的保存
带有超薄切片的载网应注意保存以防止尘土等污染，最好贮存于专供存放载网用的载网盒内。载网盒放于干燥皿中。若无载网盒可用医用胶囊贮存，每囊放一个带有切片的载网。用以上方法存放的载网切片可保存数年而不会变坏。
（八）生物样品的其他制备技术
1.负染色技术
负染色，又叫阴性反差染色，细微结构本身不被染色，而是样品结构周围被染色，即背景被染色而散射电子的能力强，在荧光屏上样品结构周围成像暗，结构本身成像浅，从而提高了结构与其背景的反差，显示了样品的结构。负染色技术的优点是简便、快速，对于生物颗粒性材料更显示出分辨率高而优于超薄切片染色法，在生物学研究中得到越来越广泛的应用。负染色技术应用于细菌、病毒、生物大分子、分离细胞器等研究方面，特别是在病毒学领域（如图1.1.5-3）。
图1.1.5-3 负染色技术示病毒图
负染色技术的突出优点是：
①大大提高了样品的反差和分辨能力；
②简便易行；
③不会使生物样品变形等。
2.扫描电镜生物样品制备
扫描电镜生物样品制备原则：
①尽可能完好地保持样品表面形貌；
②使样品脱水干燥并避免因干燥引起的变形；
③增强样品表面导电性和二次电子发射率。
扫描电镜生物样品制备的步骤为：取材、清洁表面、固定和脱水、样品的干燥、样品表面导电处理等。
（1）取材
注意保护观察面，所切取的样品比透射电镜样品大些，可视样品台的大小而变化，一般应小于10mm2，并尽可能薄。
（2）清洁表面
清除表面黏液、杂质、灰尘等附着物，充分暴露样品表面。常用的清洗液有蒸馏水、生理盐水、缓冲液及含酶的清洗液等。根据研究对象样品性质特点，采取不同的清洗方法。例如动物脏器腔面含有较多黏液，用含酶的清洗液清洗效果好。附着在微绒毛及表面凹陷处的微小杂质颗粒，一般漂洗不易清除，可配以超声波清洗方法。漂洗过程要注意pH和渗透压的影响。对于表面干燥的样品，可用吹毛球或软毛笔轻轻扫除的方法清洁表面。
（3）固定和脱水
固定、漂洗和脱水等处理所用试剂与透射电镜样品的制备方法相同。常用的固定方法是戊二醛-四氧化锇双重固定法，这是目前公认最好的方法；也可采用戊二醛单固定法。常用的脱水剂是乙醇或丙酮。脱水剂浓度按梯度增加，容易变形的样品，脱水剂的浓度梯度宜缓慢递增。
（4）样品的干燥
脱水后，需要将样品中的化学脱水剂彻底挥发干净，这就是样品的干燥。样品干燥的方法包括：空气干燥、真空干燥、冷冻干燥、临界点干燥等。
（5）样品表面导电处理
其目的是增强导电能力消除荷电效应及增加样品表面二次电子发射率，加强信号，提高图像反差。通常使用的方法是金属镀膜法和组织导电处理技术。
扫描电镜的应用见图1.1.5-4、图1.1.5-5。
图1.1.5-4 扫描电镜示人成纤维细胞结构图
图1.1.5-5 扫描电镜示大肠杆菌图