二、流式分选
（一）分选型流式细胞仪的基本结构与原理
分选型流式细胞仪的基本结构和分析型流式细胞仪相比多了一个分选系统（如图1.1.6-8），它先对样品细胞进行分析，判断出目标细胞，然后进行分离回收。回收后的细胞具有活性，并且可以再进行培养。与分析型流式细胞仪不同的是分选型流式细胞仪的液柱是不连续的。分析型流式细胞仪液流中的鞘液流和样品流是相对独立的，而分选型流式细胞仪液流中的鞘液流和样品流是相互混合的，由于喷嘴高频振动，经过喷嘴后形成一个个独立的液滴，称之为“打点”，理想的条件下每个点刚好含有一个细胞。例如仪器每秒钟打点1×105个，就可以分选1×105个细胞。
图1.1.6-8 分选模式图
当一个细胞流经液柱时，先被激发光激发，然后检测系统即可得到这个细胞的各个参数，判断这个细胞是不是目标细胞，如果是目标细胞，当细胞从连续液柱进入到下一滴独立液滴时，仪器就给整个液柱通电，当包含该细胞的液滴从液柱上脱落后，此时已带电的液滴会经过高压电（3000～4000V）形成的磁场偏离原来的下落轨迹滴落到接收管中，不带电的液滴就会直接经废液口进入废液桶。根据液滴所带电荷的正负性和带电荷的多少、通过磁场时偏离的方向和偏转角的不同，可同时实现多路细胞的分选。
（二）基本操作
1.样品的准备
与流式分析的样品制备方法一致。但是分选型流式细胞仪上样管比较长，而且分选的时间也长很多，因此容易堵塞喷嘴。所以上样前，样品细胞必须用滤网过滤，以去除大颗粒杂质、死细胞团块、细胞聚集块。可在样品中加入血清保持细胞的活力，减少分选过程中细胞死亡结块，加EDTA可减少细胞聚集。
2.分选模式选择
流式分选是以液滴为单位进行分选。由于细胞在液体中的分布不均匀，就可能造成有的液滴里没有细胞，有的液滴里不止1个细胞，并且这里面有目标细胞，也有非目标细胞，这就要求有标准的分选模式。根据分选目的的不同可选择不同的分选模式。
（1）纯化模式
纯化（purify）模式是最常见的分选模式。它只收集液滴中只有目标细胞的液滴，该液滴中可能不止1个目标细胞。当液滴中不但有目标细胞也有非目标细胞时，就不选择这个液滴，这样就保证了液滴的纯度。
该模式所获细胞虽然纯度很高，但得率会降低。因为有很多有目标细胞又有非目标细胞的液滴没有被收集到。通过降低样品的浓度，保证总的细胞数少于得到的液滴数，使所有的细胞都有机会独自分配到1个液滴中。同时在进样时不断振荡样品，使细胞尽量均匀地分布于样品中，减少2个以上细胞共存于1个液滴中的概率，提高分选的得率。
（2）富集模式
富集（enrich）模式就是将只要含有目标细胞的液滴都收集起来，不管这个液滴中是否包含非目标细胞。理想的条件下，所有的目标细胞都可以被收集到，细胞得率可达到100%，但是纯度无法保证。如果希望提高目标细胞的纯度，可适当降低样品细胞的浓度，减少1个液滴中有2个以上细胞的概率。
选用富集模式时一般不会太注重分选的纯度，否则不会用这种模式。但当样品中目标细胞的比例较低时，如果直接用纯化模式，分离到的细胞纯度不会很高，同时得率也会很低。这时可以先用富集模式收集含目标细胞的液滴，再用纯化模式分选目标细胞。
（3）单细胞模式
单细胞（single）模式应用不是很广。在该模式下，只有1个细胞而且是目标细胞的液滴才被分选收集。如果液滴中不止1个细胞，即使里面的细胞都是目标细胞也不被收集。这时，就要求样品细胞的浓度尽量低一些，保证每1个液滴内最多只有1个细胞。
单细胞模式和纯化模式分选的细胞纯度都很高，虽然得率不如富集模式高，但它能够精确计数分选后得到的细胞。这种模式一般用于要求精准细胞数的实验，如在微量孔中进行单克隆扩增。
3.分选速度控制
分选速度就是每秒被激光分析的细胞数。它是由上样的细胞浓度和上样时液体流速决定的。当样品浓度一定时，分选速度则由液体流速控制。而液体流速的控制是通过调整样品流和鞘液流的压力差来实现的。样品流压力越大，样品液柱就越宽，液流速度就越大。
分选型流式细胞仪都有一个最高分选速度，它是由喷嘴打点的频率决定的。例如喷嘴每秒打点1×105个，从理论上讲，分选速度可以达到1×105个/s。但实际情况是细胞不可能平均分布到每个液滴中。有的液滴内没有细胞，有的液滴内有两个以上细胞。因此，实际分选过程中最好不用最高分选速度。一般根据分选模式的不同选择分选速度。用纯化模式时，包含非目标细胞的液滴不被选，为了保证分选得率，分选速度不应超过最高分选速度的50%；而富集模式，分选速度可适当提高，但为了提高分选纯度，速度也不宜过快，一般不要超过最高分选速度的80%。实际工作中，分选速度的控制还要根据具体情况和经验灵活掌握。
（三）流式分选术的应用
流式分选术用荧光素偶联抗体标记样品细胞，通过分析、分选得到纯度高的目标细胞，是细胞学研究中关键的一步。近年来，流式分选术已广泛运用到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学等领域的研究。
1.分选独立群体细胞
独立群体细胞是指要分选的目标细胞在流式图中独立成群，在荧光强度上与非目标细胞有明显的界线，这是分选细胞最理想的情况，分选到的细胞得率和纯度都最好。为了使目标细胞形成独立群体，首先要选择和非目标细胞表达量差异最大的抗原分子作为目标细胞的特征性标志，而且这个标记分子应位于细胞表面，不需要任何处理，荧光素偶联抗体就能直接与细胞表面的抗原结合，细胞的活性不受影响，而且测得的荧光信号差异也会最大，通过流式图很容易将目标细胞和非目标细胞区分，从而达到分选的目的。其次，选择荧光信号较强的荧光素，可以使目标细胞和非目标细胞之间的荧光信号差异更大。
2.分选非独立细胞群
如果目标细胞和非目标细胞抗原分子表达的差异不大，在流式图上达不到完全分界，此时目标细胞就是非独立细胞群。这时设门就显得十分关键，理想的设门就是既要保证目标细胞的纯度又要提高细胞的得率。在实际分选时，根据经验设门分选一段时间后，上样分析分选得到的细胞，判断此设门是否理想，再调整设门，然后再分选、分析，直到设门满意为止。
3.分选低比例细胞群(https://www.daowen.com)
低比例细胞群体是指需要分选的目标细胞占样品细胞的比例小于1%的细胞群体。由于属于弱势群体，在流式分选时往往得不到理想的纯度和得率。这个问题可以通过2种方法得到解决：
（1）流式分选结合磁性分选
先用磁性分选的方法富集目标细胞，去除或减弱强势细胞群的影响，提高目标细胞群的比例，然后再用流式分选达到分选的目的。
（2）二次分选法
第一次采用富集模式分选，虽然得不到满意的结果，但通过恰当设门至少使低比例细胞群的比例有所升高，然后第二次采用纯化模式分选就可得到较理想的结果。这种方法一定要考虑目标细胞能否接受2次分选的电刺激，否则分选出来的细胞大部分会死亡，也就失去了分选的意义。
4.分选造血干细胞
造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）是造血系统中一群最原始的细胞，它具有自我更新、自我维持并向多系分化和增殖的能力。由于造血干细胞在形态学方面与其他细胞无法区别，而且数量极少，这给它们的分离纯化造成极大的困难。近年来对小鼠和人造血干细胞表面标志的研究已取得很大的进展，利用荧光素偶联单克隆抗体通过流式分选技术可对它们进行分离纯化，为它们功能分析和分化的研究提供了有力的平台。
5.分选肿瘤干细胞
肿瘤干细胞是肿瘤中具有自我更新、无限增殖及多向分化潜能的细胞，这部分细胞虽然只占少部分，但在肿瘤的发生、演进、复发、耐药及逃逸免疫系统的识别和清除过程中可能发挥了至关重要的作用。因此，根据肿瘤干细胞表面的标记物通过流式分选技术有效地将肿瘤干细胞分离出来，将有助于人们深入了解肿瘤的发病机理，从而建立新的有效的治疗方法。
附：单个细胞悬液的制备
一、单层培养细胞分散为单个细胞
1.将单层培养细胞（对数生长期）中的培养液倒掉。
2.加入少量0.25%胰酶冲洗后倒掉。
3.加入1～2mL0.25%胰酶后在倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆，弃去胰酶，加入PBS液后轻轻反复吹打，收集细胞。
二、外周血单个核细胞（PBMC）分离
用Ficoll-hypague密度梯度离心法分离PBMC：
1.抽取适量的血液加于含有抗凝剂的离心管中，并加入等量的PBS液。
2.取另一支离心管，加入Ficoll分离液至离心管1/4处，然后慢慢将稀释的血液小心叠加到分离液的上层，加入量为分离液的2.5～3倍为宜。
3.置离心机中，2000r/min离心30min。
4.轻轻取出离心管，用毛细吸管吸出中间有白色絮状物（PBMC）的液体层，置于新的离心管中。注意避免吸入下层的红细胞，尽量吸取所有白色絮状物。
5.得到的细胞加入PBS液，清洗2次，每次以800～1000r/min离心以除去血小板，得到的沉淀即为PBMC。
三、小鼠脾脏淋巴细胞的制备
1.颈椎脱臼处死小鼠，用75%乙醇浸泡3min。
2.无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5mL无血清培养液冲洗一次。
3.将脾脏置于无菌的200目不锈钢网或尼龙纱网上，用注射器芯轻轻研磨，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中；或用注射器向脾脏内注入3mL无血清培养液、反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可。
4.将收集到的细胞悬液用Ficoll液分离；或用红细胞裂解液裂解红细胞，离心后收集细胞沉淀，重悬后得到脾单个细胞悬液。
四、实体脏器样品的制备
实体脏器如肝脏、肺脏及肿瘤组织含过多的结缔组织，直接研磨无法得到理想的单个细胞悬液，因此，研磨前需要先将脏器剪碎后加入Ⅳ型胶原酶消化后再进行研磨。消化时间视脏器的不同而不同：肝脏结缔组织含量相对较少，一般消化0.5～1h；肺部组织较韧，完全消化大约需3h；肿瘤组织一般需要1～2h。研磨的步骤见脾细胞制备，如果研究的目的是实体细胞可省去第4步。
（于红娟）