一、流式分析
（一）分析型流式细胞仪的基本结构和原理
流式细胞仪的工作原理简单说就是通过液流压力作用形成一条高速流动的极细的液柱，液柱中的细胞只能单个依次高速通过，当激光照到高速流过的细胞时，收集分析散射光和荧光信号从而得到细胞的各种特征。流式细胞仪主要由液流系统、光学系统和电子控制系统三大基本结构组成（如图1.1.6-1）。三个系统安装在相互垂直的三个轴线上，即X轴方向为激发光轴线、Y轴方向为光信号检测轴线、Z轴方向为细胞流轴线，三个轴线的交点为信号检测区。
图1.1.6-1 流式细胞仪基本结构示意图
1.液流系统
液流系统是流式细胞仪的心脏。它是由两条相对独立而又紧密联系的液流组成（如图1.1.6-2），分别为鞘液流和样品流。样品悬液在液流压力的作用下从样品管中射出，鞘液流的鞘液来自鞘液桶，流经流动室（又称喷嘴）后与样品流汇合。但它们并没有混合在一起，而是形成层流，样品流在内，鞘液流包裹在其外，这是由于样品流和鞘液流的压力不同造成的（一般样品流的压力要大于鞘液流的压力）。流动室出口直径很小，根据规格的不同有70μm、100μm、200μm等，不同的研究领域采用不同的喷嘴，如免疫学研究最常用的是70μm的喷嘴。从流动室流出的液流很细，位于中央的样品流更细，从而保证样品流中的细胞只能以单个细胞的方式依次排列在样品流中，经过激光照射后，通过接受散射光和荧光信号就可得到每个细胞的数据。
图1.1.6-2 流式细胞仪液流系统示意图
2.光学系统
流式细胞仪对细胞的分析是以激光照射后接收到的光信号为基础的，所以光学系统是流式细胞仪的灵魂系统。光学系统始于激发光源——激光器，激光器常根据其激光的发射波长分类，最常见的是能够发射488nm波长的蓝激光器，所有型号的流式细胞仪都配备有此激光器，另外还有635nm的红激光器、405nm的紫激光器和355nm的紫外激光器等。
流式细胞仪的光学系统除激光器外，还包括若干透镜、滤光片和小孔等。通常由2个十字交叉的圆柱形透镜组成光束成形器，将光束聚焦并定形为相同大小的椭圆形。光束大小为（15～25）μm×（50～60）μm，接近细胞的大小，当细胞列队快速通过激光束时，只照射到一个细胞，避免了较大光束中同时存在2个细胞而相互干扰和较小光束照不到液流边缘细胞的情况。滤光片则是将接收到的散射光和荧光根据不同的波长分开，通过相应的光电倍增管（photomultiplier tube，PMT）检测而得到数据加以分析。流式细胞仪滤光片主要有三类：长通滤片（long pass filter，LP）、短通滤片（short pass filter，SP）和带通滤片（band pass filter，BP）。长通滤片使特定波长以上的光通过，该波长以下的光则被反射；短通滤片使特定波长以下的光通过，该波长以上的光则被反射；带通滤片允许相当窄的一段波长范围内的光通过，该范围以外的光将被反射。这三种滤光片相互组合，可将散射光和荧光根据波长不同分开，然后被不同检测通道接收后进行分析。
3.检测分析系统
激光照射到细胞后得到的散射光和荧光通过光路系统被分为不同波长的光被各自的检测通路接收，最后通过光电倍增管转化成较强的电子信号，由计算机上特定的软件进行处理分析。
流式细胞仪接收的信号有2种，即散射光信号和荧光信号。
（1）散射光信号
散射光包括前向角散射（forward scatter， FSC）和侧向角散射（side scatter，SSC）（图1.1.6-3）。FSC信号是激光通过细胞后在激光正前方接收到的散射光信号，主要反映被测细胞的体积大小。细胞的FSC值越大，代表细胞的体积越大。通常选用FSC值作为阈值参数，如将FSC值的阈值设为5%，表示FSC值最小的5%的信号将不被分析，这些信号代表的是一些细胞碎片或者小颗粒，而不是细胞。SSC 信号是激光束通过细胞后在与激光90°位置接收到的信号，它主要反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。细胞的SSC值越大，代表颗粒度越大，如细胞形态不规则、细胞膜多突起、胞质内颗粒较多。因此，FSC值和SSC值被称为细胞的物理参数，反映细胞的大小和内部结构。在实验中，常利用FSC值和SSC值这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
（2）荧光信号
荧光信号是将细胞标记荧光素偶联抗体时，在相应的激光激发下产生的，在激光90°位置（同SSC）接收到的发射光信号。在相应的通道经光电倍增管收集得到荧光信号，根据是否接收到荧光信号来判断该细胞是否表达相关分子，并可根据荧光强度判断细胞表达相关分子的多少。荧光信号分析是流式细胞仪最重要的功能，也是其能够得到广泛应用的原因之一（如图1.1.6-3）。
图1.1.6-3 光信号接收示意图
（二）流式图
流式细胞分析软件采用流式图来分析处理流式结果。流式图有很多种，常见的有单参数直方图、双参数散点图、二维等高线图。最常用的是单参数直方图和双参数散点图。
1.单参数直方图
单参数直方图是一维资料中用得最多的图形，它只能显示一个通道的信息，代表一群细胞某个参数的情况，可用于定性及定量地对资料进行分析。图中，通常横坐标表示FSC或SSC的大小、荧光信号强度，纵坐标代表细胞出现的频率或相对细胞数。
图1.1.6-4是从实验中得到的CD3、CD4、CD8阳性细胞比例测定直方图。横坐标表示的分别是荧光素偶联抗CD3、CD4、CD8单抗后的荧光强度值，纵坐标表示细胞的数量。从图中可以看到两个峰，荧光强度较弱的左峰分别代表的是CD3、CD4、CD8阴性细胞，荧光强度较强的右峰分别代表的是CD3、CD4、CD8 阳性细胞，阳性细胞的比例是通过线性门进行测量的。
图1.1.6-4 CD3、CD4、CD8阳性细胞比例测定直方图
2.双参数散点图
双参数散点图是最常用的流式图，它可以同时显示两个通道的信息，表示一群细胞两个参数的情况。图中，横轴与纵轴分别代表被测细胞的2个测量参数，根据这2个参数值可以确定细胞在图中的位置。最常用的基本表示法是点密度图。每一个点代表一个细胞，该点所对应的横轴和纵轴就代表这个细胞的2个参数值。
图1.1.6-5是小鼠脾细胞中CD3、CD4、CD8阳性细胞比例测定散点图。先通过FSC/SSC图将淋巴细胞圈P1门，之后根据荧光素偶联抗CD3、CD4、CD8单抗标记后细胞的荧光强度值，区分CD3、CD4和CD8阳性细胞群体，分析不同实验样品之间T细胞亚群的差异。
图1.1.6-5 CD3、CD4、CD8阳性细胞比例测定散点图
3.二维等高线图
流式的等高线图和散点图相似，都能代表两个通道的信息。它借助地理等高线图的形式用封闭的环线表示细胞密集的程度，同一个环线上细胞的密度相同。环线聚集越多的地方说明这个区域的细胞数目密度变化越快。细胞最稀疏的地方还是用散点图表示，环线的中央区域代表细胞聚集的中心（如图1.1.6-6）。相比之下，散点图更为直观，所以应用更为广泛。
图1.1.6-6 CD3阳性细胞比例测定等高线图
4.门与设门
在得到流式图形资料后，如果要分析某一细胞群，可将它圈定起来形成一封闭的区域，我们将其称为“门”，这一步骤称为“设门”。流式细胞术的分析过程实际就是选门和设门的过程。一般情况下，流式分析首先是在FSC-SSC图设门，最简单的设门就是根据细胞的大小和颗粒度区分细胞群体，选定其中想要分析的特定细胞群，只对该群细胞进行进一步的分析。门根据形状可分为矩形门、椭圆形门、多边形门、十字形门和区域门。如图1.1.6-7所示，欲分析CD3+CD4+T细胞占淋巴细胞的比例，首先在A图以散射光信号FSC和SSC二维点图设门（P1）去除死细胞和碎片（靠近左下角），P1门内圈定的细胞为淋巴细胞，然后在B图中仅对P1门内细胞进行进一步分析，其横坐标和纵坐标的荧光强度分别代表CD3和CD4分子的表达，在图中设十字门，其中右上象限（Q9-2）区域内的细胞CD3和CD4分子同时阳性，显示的数据为CD3+CD4+T细胞在淋巴细胞群中的百分率。
图1.1.6-7 CD3+CD4+T细胞比例分析散点图
（三）基本操作
1.样品制备
流式细胞仪是对单个独立的细胞进行分析的，因此要求样品是单个细胞悬液，这里简单介绍如何制备单个细胞悬液。
如果目的细胞是来源于体外的培养细胞，若为悬浮细胞，直接收集即可，若为贴壁细胞，需将细胞用胰酶消化后收集；如果来源于外周血，目的是分离出单个核细胞，只要用Ficoll密度梯度离心分离就能得到单个核细胞悬液；如果目标细胞是来源于胸水、腹水或脑脊液等体液，将标本离心洗涤，最后用滤网过滤即可。
如果要从免疫器官如胸腺、脾脏和淋巴结中获得单个细胞，可直接用研磨棒将样品组织在滤网上小心磨碎，过滤后得到单个细胞悬液，研磨时注意不要用力过大，否则细胞悬液中会存在大量死细胞和细胞碎片，影响实验结果。骨髓组织比较疏松，用吸管反复吹打即可得到单个细胞悬液。(https://www.daowen.com)
如果是实体脏器，如肺脏和肝脏，可以将组织剪成碎片，再加入用于消化的Ⅳ型胶原酶消化一定的时间，用研磨棒磨碎后过滤就可以得到单个细胞悬液。
2.荧光素的选择
荧光素多是一些化学试剂，它在未激发时外层电子处于基态，当受特定波长激光的激发后，外层电子接收到足够的能量跃迁到激发态，处于激发态的外层电子不稳定，会自发地从激发态回到基态，同时释放出特定波长的荧光。不同的荧光素有其特定的激发光和发射光，流式分析时可以同时标记发射不同波长荧光的荧光素，这些荧光素被激发后发射不同的荧光，被不同的检测通道接收，这就使流式多荧光通道分析成为可能。常用的荧光素见表1.1.6。
表1.1.6 流式细胞分析常用的荧光素
FITC是流式细胞术最常用的荧光素，该荧光素较为稳定，与FITC偶联的抗体种类最多。FITC由最常见的488nm激光器激发，其发射的荧光信号被第一荧光通道（FL1）接收，单色分析时常用FITC偶联抗体。PE荧光素使用范围也很广，同样由488nm激光器激发，发射的荧光信号被第二通道（FL2）接收，其荧光信号较强，适用于弱表达的抗原分子的分析。由于不同型号的流式细胞仪使用不同的激光配置和不同的荧光检测滤片组合，因此荧光素的选择与仪器的机型有关。在做多色荧光分析时，除了要了解荧光素的激发波谱和发射波谱外，还应了解常见的荧光素组合。例如FITC+PE是最常用的双色组合；FITC+PE+PerCP是最常见的三色组合等等。
3.荧光素偶联抗体标记细胞
荧光素偶联抗体通常为单克隆抗体，后者与细胞上抗原特异性结合而使得荧光素标记在细胞上。荧光素偶联抗体标记细胞的方法有直接法和间接法。直接法采用荧光素偶联抗体直接与细胞上的待测抗原结合而使细胞被标记，操作简单，可同时与多种荧光素偶联抗体结合而进行多色分析，应用广泛。间接法染色需两步完成，细胞抗原首先与一抗结合，形成抗原-抗体复合物，然后与荧光素偶联二抗共同孵育，使结合至细胞上的一抗与荧光素偶联二抗发生特异性结合，从而使细胞上标记荧光，该法操作复杂，且同时只能进行一种抗原的检测，因此应用较少。荧光素偶联抗体直接标记细胞的方法比较简单，样品加入一定浓度的相应的荧光素偶联抗体，充分混合后4℃静置30min，然后用PBS洗2遍，将游离的抗体洗去即可上机检测。由于很多免疫细胞都表达Fc受体，容易与抗体的Fc段发生非特异性结合而引起假阳性结果，因此样品在标记之前先要将细胞表面的Fc受体进行封闭。
4.光电倍增管电压的设置
光电倍增管（PMT）不仅将各通道检测的荧光信号转变为电子信号进行分析，而且在转变信号时能够提高电子信号的强度，这是通过分析软件调节PMT的电压而实现的。电压设置越高，得到的电子信号越强；反之，得到的电子信号越弱。每一个流式通道都配置一个PMT，都可以设定各自的电压。只有设定合适的电压，才能保证在流式分析时得到正确的结果。
PMT的电压设定没有一个固定的最合适的值，流式细胞仪的类型、检测通道、样品细胞、荧光素偶联抗体的种类和标记方法都会影响光电倍增管的电压设定。
5.对照设置
阴性对照的设置是流式细胞术不可缺少的重要环节。因为每一个细胞都会发出非特异性荧光，而且不同的细胞非特异性荧光有时相差很大，因此要设置一个不标记荧光抗体的样品细胞作为对照。为了排除荧光素偶联抗体与细胞的非特异性结合而产生的非特异性荧光，一般还要设置同型的荧光抗体对照。阳性对照是为了检测该荧光素偶联抗体是否有效而设置，一般在第一次使用新的荧光素偶联抗体时，用已知表达相应抗原分子的样品标记这种荧光抗体作为阳性对照。
6.补偿调节
补偿调节是流式细胞分析中一个非常重要的环节，用于纠正光学检测器间由于荧光叠加造成的检测误差。在进行多色分析时，当激发光照在偶联了荧光抗体的细胞上时，发出荧光，在90°位置上接收到不同波长的荧光，仪器通过各种滤光片将不同波长的荧光分开，进入不同的检测通道。一个通道一次只能检测一种荧光，不能同时检测多种荧光，而且一种荧光只能在特定的通道内被检测。然而一种荧光素的发射波长并不是绝对固定于某个数值，它可以某一特定数值为中心发散分布，如FITC荧光素，被488nm激光激发后发射的荧光信号大部分集中于510～550nm，被第一通道（FL1）接收，少部分位于565～595nm之间的信号被第二通道（FL2）接收，而FL2应该接收的是PE发出的荧光信号，导致FL2接收到的是混合荧光信号，无法判断这2种信号的来源。为了减少某一接收通道接收到其他通道的交叉信号，应增加样品的对照组，如不标记荧光素偶联抗体的空白对照组、分别只标记一种荧光素偶联抗体的补偿组进行补偿调节。补偿调节就是通过调节仪器的电子系统或通过软件调节而消除进入某通道的交叉信号，从而减少干扰，获得真实的数据。
7.阈值的设定
由于流式细胞术分析的对象是细胞，而细胞样品在处理过程中不可避免地存在或多或少的细胞碎片，流式细胞仪又无法将细胞碎片自动过滤而只分析细胞，因此可以通过设定阈值的方法来避免细胞碎片对分析结果的干扰。
设定阈值首先需要确定阈值通道，即根据哪一个检测通道来设定阈值。最常用的阈值通道是FSC通道，FSC的大小反映的是细胞的体积大小，而一般细胞碎片的体积都比细胞小，因此以FSC的大小设定阈值比较理想。阈值常用百分数表示。设定的阈值是一个经验数值，原则就是能够将大部分细胞碎片排除，又能保证细胞不会被排除。例如，将细胞阈值设定为4%，如果阈值通道为FSC，就表示每检测100个对象就会自动排除最小的4个对象，这4个对象的数据不会显示于流式图中。阈值可以根据每批的细胞样品质量来设定。如果细胞制备不理想，细胞碎片或小颗粒物较多，可以相应提高阈值。
8.流式分析中死细胞的问题
流式分析所分析的应该是活的细胞，而样品细胞中都有一定量的死细胞，在进行流式分析时将死细胞当作活细胞来分析，会严重影响分析结果。首先在细胞样品制备的过程中要尽可能减少细胞的死亡。如处理细胞要及时，动作要轻柔，配液时确保溶液的适当的渗透压和pH值，离心时速度要低、时间不能过长，制备好的细胞不可放置时间过长，要尽快上机检测，4℃保存最好不超过10h。样品细胞中不可能完全排除死细胞，还需在分析时进行分辨。可以通过核酸标记染料7-AAD（7-氨基放线菌素D）标记死细胞或设门时将对角线死细胞画出等方法进行排除。
9.上样速度的控制
流式分析时对上样速度要求不是很严格，分析型流式细胞仪一般简单设置几档分析速度供选择。总的来讲低速上样时，样品压相对较低，样品流的直径最小，样品流内的细胞居于正中的概率最大，激光从正中穿过待分析细胞的概率最高，分析得到的数据也就最真实。但是，如果样品细胞数量过大，低速分析花费的时间就可能很长。因此在实际检测中，可以根据样本量的大小适当调整上样速度。
（四）流式分析细胞术的应用
流式细胞仪是现代细胞学分析技术中最常用的仪器，它具有快速、准确、量化等优点，已被广泛应用于免疫学、细胞生物学、血液学、肿瘤学等几乎所有生命科学领域。目前应用最广的有以下几方面：
1.细胞及亚群表型分析
不同种类的细胞群在各自不同分化成熟阶段以及活化过程中，其细胞膜表面表达不同的特征性分子，成为细胞的特有的表面标志，即特征表型。研究一群细胞，分析其表型是很重要的一个环节，不仅可以明确这群细胞的独特之处，而且可以从一定程度上判断这群细胞的功能状态，尤其在研究一种新细胞或者细胞亚群时，该细胞的表型测定是研究的基本要求。利用细胞表型来区别于其他细胞，如：免疫细胞的特征表型是CD45；T淋巴细胞的特征表型为TCR和CD3，进一步分为CD4+T细胞和CD8+T细胞，而CD4+T细胞中包含CD25+调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）；B细胞主要表达BCR、CD19；NK细胞的特征表型为CD16和CD56。这些细胞群用单个表型特征或2个及2个以上的表型特征来区别。利用荧光素标记单克隆抗体通过流式细胞术可对细胞表型进行检测，进而对细胞的种类、亚型及功能特征进行分析。
2.细胞亚群比例测定
测定某种细胞或细胞亚群的比例是流式细胞术最简单、最基本的应用。首先要明确需要检测的总体细胞群。比如要检测T淋巴细胞的亚群CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例，可将淋巴细胞群作为整体，将细胞群用T细胞特有的标志分子CD3及CD4、CD8分子的不同荧光素偶联抗体染色后，通过流式细胞仪进行检测。得到流式图后先根据FSC和SSC的特性圈出淋巴细胞，再选择双阳性细胞进行比例分析。
细胞亚群比例分析应用最广的是淋巴细胞及其亚群的检测。淋巴细胞是免疫系统中最重要的一群细胞，是参与机体免疫调节和执行免疫功能的免疫活性细胞。这些细胞及其亚群可发生动态变化。通过用流式细胞仪检测淋巴细胞亚群的比例，对了解疾病的发病机制、辅助诊断及判断疾病的转归有着重要的意义。
3.细胞因子的检测
细胞因子（cytokine，CK）是指多种细胞，特别是免疫细胞合成和分泌的具有高活性、多功能的小分子多肽和糖蛋白，它具有介导和调节免疫应答、参与免疫细胞分化发育、介导炎性反应、刺激造血和组织修复等作用。正常情况下，细胞因子的表达和分泌受到机体严格的调控，但在病理状态下，细胞因子会出现异常表达。因此，检测细胞因子的表达对于某些疾病的诊断、治疗具有重要的价值。检测细胞因子常用ELISA 法，而利用流式细胞仪检测细胞因子有以下2种方法：
（1）胞内染色法
胞内染色法是细胞内细胞因子表达的检测方法。首先用适当的刺激剂激活细胞表达相应的细胞因子，再加阻断剂阻断蛋白质的转运，阻止细胞因子分泌到胞外，再经固定、细胞膜打孔、加入荧光标记抗体，用流式细胞仪进行检测。胞内染色法只能检测到胞内细胞因子的表达，而不能检测到分泌至细胞外的细胞因子的量，ELISA法则相反。将2种方法结合起来就能全面反映某种细胞分泌某些细胞因子的情况，一般先用胞内染色法进行定性检测，再用ELISA法对分泌出的细胞因子进行定量分析。
（2）CBA法
流式细胞小球微阵列（cytometric bead array，CBA）术是基于流式细胞检测系统的微量多重蛋白定量分析方法。利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性，将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上，即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。CBA技术的基本原理近似于ELISA，先用微球结合特异性细胞因子抗体，然后与待测标本混合，再加入荧光标记抗体，就会形成“三明治”夹心复合物，最后通过流式细胞仪进行检测。CBA技术融合了芯片技术的理念，一次可以同时检测多个细胞因子。每种微球携带有不同强度的红色荧光，在流式细胞仪的FL3通道检测微球荧光强度的差异对目的蛋白进行定性分析；检测抗体带有PE荧光素，在流式细胞仪的FL2通道检测，通过检测抗体的PE荧光强度对目的蛋白进行定量分析。
4.细胞增殖能力检测
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（5，6- carboxyfluorescein diacetate， succinimidyl ester，CFSE）是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺酯基团和非酶促水解作用的羧基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。当CFSE以含有2个乙酸基团和1个succinimidyl ester（琥珀酰亚胺酯）功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境时，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断地降低，从而分析得出细胞分裂增殖的情况。
5.在细胞周期研究和DNA倍体分析中的应用
流式检测细胞周期是通过检测细胞DNA的含量来反映细胞所处的周期。G0期的细胞处于相对静止的状态，不参与增殖，所以是二倍体的细胞，含二倍体量的DNA；G1期是DNA合成前期，此时DNA合成没有开始，其含量与G0期一致；细胞进入S期，DNA进行复制，其含量从二倍体到四倍体呈现一个连续变化的过程；当细胞进入G2期时，DNA复制已经完成，此时是四倍体；当细胞进入M期时，在有丝分裂完成之前DNA仍是四倍体。将DNA用非特异性核酸荧光染料（如PI、EB、AO等）标记后，经流式检测得到荧光信号的强度代表了DNA的含量，荧光信号强度越大，DNA的含量越高，从而推断细胞所处的细胞周期。由于细胞在不同的细胞周期所表达的特异性调节蛋白不同，检测DNA含量的同时标记荧光素偶联的这些蛋白分子的单克隆抗体，通过流式检测后就可以准确区分G0期、G1期、S期、G2期和M期。譬如，同是二倍体的G0期和G1期的细胞，G0期细胞不表达cyclin D和cyclin E，检测这些蛋白分子可以区分G0期和G1期。标记细胞周期蛋白分子有助于检测肿瘤细胞经常出现的反常细胞周期。通过DNA分析还可以了解细胞的倍体数。DNA非整倍体的出现率与癌变和不典型增生程度密切相关，DNA非整倍体可能是癌前病变到癌变的一个早期指标。近年来，流式细胞DNA分析越来越多地应用于实体瘤患者的检测，为肿瘤的诊断提供佐证。
6.细胞凋亡分析
细胞凋亡（apoptosis）是指细胞在一定的条件下，主动有序地结束自己生命的过程。细胞凋亡在生物体中是普遍存在的，个体发育、衰老细胞的清除等都与细胞凋亡密切相关，特别在免疫学中尤其重要。最典型的例子是T细胞的分化发育，在胸腺中95%以上的胸腺细胞都会因为能够与自身抗原结合而凋亡，从而避免了T细胞因结合自身抗原而产生自身免疫性疾病。用流式细胞术能够从多方面定量分析和鉴定细胞凋亡，具体包括散射光、caspases、线粒体膜电位、质膜运输功能和通透性、DNA含量分析以及凋亡相关分子（Bcl-2、c-myc、ras等）等检测，涵盖了细胞凋亡早期到晚期的全过程。最常见的检测方法有两种：
（1）Annexin V/PI双色法
当细胞凋亡或坏死时，细胞表面发生变化，本来位于细胞膜内表面的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）转移到细胞膜的外表面，用一种对PS高亲和性的Annexin V结合蛋白与细胞膜外表面的PS结合，通过与Annexin V偶联的荧光素标记凋亡细胞。为了区分细胞是凋亡还是坏死，再加入PI荧光染料，由于凋亡细胞的细胞膜是完整的，PI不能进入细胞内，因此检测到的凋亡细胞PI呈阴性，坏死细胞PI呈阳性。另外，还可以通过DNA分析是否有亚二倍体的形成及细胞周期的变化来反映细胞凋亡的状况。
（2）线粒体损伤检测法
线粒体在细胞凋亡中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子可诱导不同细胞凋亡，在细胞凋亡级联反应过程中最早发生的就是线粒体内膜通透性改变引起的跨膜电位的下降。亲脂性阳离子荧光染料（如JC-1，5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl imidazolcarbocyanine iodide）可结合到线粒体基质。正常细胞的线粒体膜电位较高，JC-1聚集在线粒体的基质中形成聚合物，其最大激发光波长为585nm，最大发射光波长为590nm，产生红色荧光，通过流式细胞仪的FL2通道检测。当细胞凋亡后，线粒体膜电位发生改变，JC-1不能进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，其最大激发光波长为514nm，最大发射光波长为527nm，产生绿色荧光，经FL1通道检测。这样可以根据荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的改变，作为细胞凋亡早期的一个指标。另外，还可以通过DNA分析是否有亚二倍体的形成及细胞周期的变化来反映细胞凋亡的状况。