一、标本的固定
（一）固定的意义
固定是指将各种组织浸入化学试剂内，使组织内的蛋白质等成分迅速凝固或沉淀，停止细胞濒死前和死亡后的变化，即防止细胞自溶与腐败，保持组织和细胞原有的形态结构。凡是需要制作后期研究的各种组织，无论是制作切片标本，还是制作大体标本，首先必须固定。在制作切片过程中，固定是最为重要的步骤，一张优秀的组织学切片是建立在适当而完全的固定基础之上的。重要的是，被固定组织在动物死后或从活体切取后要尽可能立即固定。及时地取材给迅速固定提供了先决条件。如果不迅速固定，造成固定不良，将导致染色不良后果。固定不良的组织，即使进行补充固定也起不到改善染色的效果。因此，组织的良好固定，应该是一次性的；某些固定剂还具有助染的作用，可使细胞各部易于着色。
（二）固定的目的和效果
固定组织的目的是设法得到接近正常生命状态的细胞结构，同时使组织硬化，便于切片和染色观察。
1.抑制自溶和腐败
组织的固定能保持细胞与生活时的形态相似。因为当机体生命活动停止或局部器官、组织割离机体之后，组织细胞的代谢功能即行丧失，新鲜组织如果不经固定，任意放置，由于细胞内酶对蛋白质的分解，以及细菌的滋生等各种因素的作用，组织容易腐烂。细胞内的蛋白质分解酶将蛋白质分解为氨基酸后脱离细胞而引起组织的自溶。
2.保存
细胞经过固定，不但可以防止自溶和细菌性腐败，而且能沉淀或凝固组织内的各种成分和病理代谢产物，如蛋白质、脂肪、糖、酶、色素、其他碳水化合物、无机成分、微生物等都可以经过固定而保存下来转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。
3.硬化
固定剂的硬化作用能使柔软组织（如脑）的质地变硬而易于取材。
4.胶质物体的固化
固定能使细胞正常的半液体状（溶胶）变为不能逆转的固体状（凝胶）。
5.鉴别和观察
固定可将各种细胞和组织成分的折光率做不同程度的改变，增强组织的折光指数，这样能使各种染色成分比未固定时更容易辨认。
6.对染色的影响
某些固定剂尚具有一定的助染作用而增进染色可使细胞各种部位易于着色，所以组织固定后有利于制片染色和在显微镜下的观察。此外，固定剂有时也会影响染色效果，导致着色效果不理想（如福尔马林对水溶猩红S染色的影响）。
7.渗透和固定
固定还可以使组织和细胞的各种渗透压不再发生改变，在制片时就能在最大范围内保持组织和细胞的原来形态。
（三）固定的方法及注意事项
为使组织固定充分，应做到固定容器要合适、固定时间要充足、固定液量要足够。
1.固定组织时，应选择合适的容器，一般容器的容积是组织的10～15倍以上。标本固定瓶以选择广口瓶为宜，这样便于固定前后组织取放，而小口瓶不仅不利于标本取放，还可能造成人为挤压组织而致形态变化。对于过大的标本，应尽快将标本切开后放于容器固定。
2.组织固定的时间要足够，根据标本体积大小不同，固定时间应有所不同，组织越大越厚，固定时间应越长，反之亦然。一般4～12h或更长。在温箱内将固定液稍加温，可使固定作用加快而缩短固定时间。
3.固定组织时，应该使用足量的固定液，多比少好，一般应为组织体积的5～10倍，最少为5倍。标本最好悬浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部，都不利于固定液对标本的渗入。标本块多时，固定时不应重叠。不要先将标本块放入容器后再注入固定液，以免标本贴附于器皿，形成固定不均匀之弊。新鲜标本应及时固定，否则或因组织陈旧，或因固定不当，而使组织原有结构消失而影响观察。
4.标本经固定后，应及时制作切片，如不能及时制片，而该固定液又不能作为保存液时，应改换适当的保存液。
5.对于某些需要制作神经染色和酶反应等切片的固定，要求较一般严格，组织的大小、固定的时间、温度的适当都应慎重考虑，尤其是对于酶反应的固定液，一般都要置于冰箱，在低温的条件下进行固定。固定不好，是得不到满意的切片和合乎标准的反应效果的。
6.组织固定越新鲜越好。组织一经离体，就能及时地固定，固定最好在组织离体后30s～1min。
7.任何固定液对人体都有损害作用，因此固定液的容器必须密闭，以防挥发损伤器官和眼睛，忌用手与固定剂直接接触，以免损伤皮肤。
（四）固定剂的选择
能使蛋白质等成分凝固的化学试剂称为固定剂，理想的固定剂应该具备下列几种性能：
1.渗透性强，固定剂必须能迅速渗入组织，这样组织内各种成分才能尽快地被固定在原位置，而不致弥散。
2.组织在固定液的作用下，不应发生显著的收缩和膨胀现象。实际上经过固定的组织，由于蛋白质发生凝固或沉淀，必然导致组织出现不同程度的收缩或膨胀。因此，良好的固定剂应尽量减少组织发生这类变化。
3.固定剂应该有利于组织切片和染色，这其中含有2种意义：
（1）固定剂对固定后的组织应有利于染色剂的染色：例如，重铬酸钾对于类脂质具有一定助染作用；中性福尔马林比一般福尔马林所固定组织更有利于核的染色。
（2）固定剂能将组织或细胞中某些必须观察的成分予充分固定而保存下来，以便染色：例如，酸可以渗入脂类物质使其固定下来而不至在制片过程中为酒精和二甲苯溶解或较少地溶解，并可用石蜡包埋进行切片。糖原的证明，则宜使用非水溶性固定剂，如无水酒精、Carnoy固定液等。(https://www.daowen.com)
4.固定液应该同时也是一种较好的保存液。实际上，没有哪一种固定液，无论是单一固定液或混合固定液能够完全达到上述要求。各种固定剂性能和作用都不尽相同，因此，对标本的固定应根据组织的制片目的和要求去选择适当的固定剂。
（五）常用固定液的种类和配方
由固定剂配制的溶液称为固定液。现有固定剂种类繁多，性能各不相同，它们对组织的固定作用各有优缺点。这些固定剂有的是氧化剂，有的是还原剂；有的呈酸性，有的呈碱性；有的渗透性强，有的渗透性弱；有些易使组织收缩，有些则使组织发生轻微膨胀现象。到目前为止还没有一种能满足所有目的的固定剂，也没有一种固定剂是适合所有组织的。因此，在标本固定中常使用2种或2种以上固定剂配制成混合固定液。在配制混合液时，应了解每种固定剂的理化性质，如氧化剂不能与还原剂混合，以免引起化学反应，失去固定作用。
1.乙醇
它对组织的固定作用是使蛋白质脱水而致不可逆性的凝固变性。乙醇可单独用作固定液；亦可用于制作混合固定液。因为乙醇是一种还原剂，所以不可与铬酸、重铬酸钾或锇酸等氧化剂相混合使用。乙醇为常用的有机溶剂，能溶解多种有机物，高浓度乙醇能凝固白蛋白、球蛋白和核蛋白，对肝糖有固定作用，核蛋白和肝糖经乙醇固定成水溶性状态，因此，经乙醇固定的标本如果固定后用水洗涤，则核着色欠佳，肝糖也将被水解。作为一种脂溶剂，浓度在50%以上的乙醇可溶解脂肪和类酯体，因此，对脂类的证明，高尔基体、线粒体等染色不宜使用乙醇做固定剂。乙醇还可溶解血红蛋白和损害多数其他色素，因此，如果证明组织蛋白的色素时也不宜以乙醇作为固定剂。
浓乙醇有较大的收缩力，被它固定的组织收缩显著，表面发硬，因而乙醇较难渗入到组织中去，组织必须用乙醇固定时宜先用80%的乙醇固定数小时，然后再换95%的乙醇，这样可以避免组织过度收缩，如需要证明尿酸结晶和保存糖类，则须用100%乙醇固定，因为尿酸盐结晶在含有水的固定液中会溶解。
2.甲醛
甲醛是通过与蛋白质结合而对蛋白质发生固定作用。甲醛是一种气体，约有40%质量溶于水，这种饱和溶液称为甲醛溶液，其商品名叫福尔马林。它是一种还原剂，颇易挥发。甲醛是一种使用广泛、简便的固定剂，同时又是一种良好的标本保存液。经它固定的标本，可适应一些特殊染色。它的渗透性较强，固定均匀，能增加组织的韧性，组织收缩轻微，硬性大于乙醇固定。甲醛能保存脂肪和类脂体，对染色体、线粒体、高尔基体具有良好的固定作用。由于甲醛能去除水溶性物质如糖原，所以不适合做电镜组织固定。
10%的中性福尔马林液（4%中性甲醛）是目前大多数病理检材采用的标准固定液。它适用于大多数特殊染色及免疫组织化学染色，但要求组织固定的时间不要太短（＜30min）或太长（＞48 h）。
3.戊二醛
戊二醛也是与蛋白交联发挥作用。它是常用的电镜标本固定液，是穿透最慢的固定液之一。所以，组织应切成1mm3的小方块，并迅速放入预冷的戊二醛中固定。戊二醛在使用前需置于4℃冰箱预冷。
4.Carnoy固定液
Carnoy固定液是一种由无水乙醇、氯仿和冰乙酸配制的混合固定液，它可以快速固定组织并很好地固定糖原、浆细胞和核酸。由于Carnoy固定液作用迅速，因此可选用Carnoy固定液固定那些需要快速处理的活检组织。
5.Zenker固定液
Zenker固定液是一种由氯化汞、乙酸和重铬酸钾等配制的混合固定液，常用于肾脏活检标本、骨髓、淋巴结和睾丸组织标本的固定。Zenker固定液能够很好地保存横纹，所以在软组织肿瘤可疑有肌源性分化时可以选用该固定液。Zenker固定液固定后组织需要在实验室用碘处理以去除汞。Zenker固定液过分固定可以使组织变得非常硬，因此固定不要超过24h，也可转移到甲醛内固定。
6.常用固定液的配方
（1）10%的中性福尔马林液（4%中性甲醛）固定液
甲醛（40%） 100mL
无水磷酸氢二钠 6.5g
磷酸二氢钠 4.0g
蒸馏水 900mL
（2）乙醇-甲醛（乙醇-福尔马林，AF）固定液
甲醛（40%） 100mL
95%乙醇 900mL
（3）Carnoy固定液
无水乙醇 60mL
氯仿 30mL
冰乙酸 10mL
（4）Zenker固定液
升汞 5.0g
重铬酸钾 2.5g
硫酸钠 1.0g
蒸馏水（加至） 100mL