原位杂交技术的基本方法
原位杂交技术的基本方法包括：杂交前准备（包括固定、取材、玻片和组织的处理、增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等）、杂交、杂交后处理、显示（包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色）。
（一）固定
原位杂交固定的目的是保持细胞形态结构，最大限度地保存细胞内的DNA或RNA，使探针易于进入细胞或组织。DNA比较稳定，mRNA相对稳定，但容易被酶合成和降解，而RNA更易被酶降解。因此在RNA的定位上，如果要使RNA的降解减少到最低限度，取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响。
1.最常用多聚甲醛固定组织，因其不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，不会影响探针穿透进入细胞或组织。
2.醋酸、乙醇的混合液和Bouin’s固定剂也能获得较满意的效果。
3.将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1～2h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中，待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。
4.组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后再将其浸入4%多聚甲醛约10min，空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定，在-70℃切片可保存数月之久不会影响杂交结果。
（二）玻片和组织切片的处理
1.玻片的处理
玻片包括盖玻片和载玻片，应用清洁剂刷洗、自来水清洗干净后，置于清洁液中浸泡24h，清水洗净烘干，95%乙醇中浸泡24h后蒸馏水冲洗，并置于温度150℃或150℃以上的烘箱烘干过夜，以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理，锡箔纸包裹无尘存放。此外，可将黏附剂预先涂抹在玻片上，干燥后待切片时应用，以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的黏附剂有铬矾-明胶液、多聚赖氨酸等。
2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
增强组织通透性常用的方法包括应用去垢剂（detergent）（或称清洗剂）Triton X-100、乙醇或某些消化酶如蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。
3.减低背景染色
背景染色的形成是诸多因素造成的。杂交后的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。
（三）预杂交（prehybridizaiton）
预杂交是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。(https://www.daowen.com)
（四）杂交（hybridsation）
杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片，防止孵育过程中杂交液的蒸发，在盖玻片周围加液状石蜡封固。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质、光滑，不会产生气泡，不影响组织切片与杂交液的接触，盖玻片自身有一定重量能使有限的杂交液均匀覆盖。可将覆有硅化盖玻片进行杂交的载玻片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate，SSC）溶液的湿盒中进行孵育。
（五）杂交后处理（post hybridisation treatment）
杂交后处理包括系列不同浓度、不同温度盐溶液的漂洗。因为大多数的原位杂交实验是在低严格度条件下进行的，非特异性的探针片段黏附在组织切片上，从而增强了背景染色。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。在杂交后，RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是漂洗的过程中，切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而增强背景染色。
（六）显示（visualization）
显示又称为检测系统（detection system）。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定，如放射自显影可利用人工或计算机图像分析检测银粒数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色，然后利用分光光度计或图像分析仪对不同类型数量的核酸显色强度进行分析。但做半定量测定必须注意严格控制实验的同一条件，如切片的厚度、核酸的保存量和取材至固定的间隔时间等。如为放射自显影，核乳胶膜的厚度与稀释度等必须保持一致。
（七）对照实验和结果的判断
对照实验的设置需根据核酸探针、靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定，常用的对照实验有下列几种：
1.将cDNA或cRNA探针进行预杂交（吸收实验）。
2.与非特异性（载体）序列和不相关探针杂交（置换实验）。
3.将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交，应用同义RNA探针进行杂交。
4.以不加核酸探针杂交液进行杂交（空白实验）。
5.用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。
6.应用未标记探针进行杂交对照。
（王 敏）