一、自由基的作用
（一）概述
自由基（free radical）是指外层轨道上含有单个不配对电子的原子、原子团或分子的总称。自由基的特点是：体内存在时间短（平均寿命1ms），化学性质极为活泼，易失去电子（氧化）或夺取电子（还原），易和其他物质反应形成新自由基，呈现连锁反应。
由氧诱发的自由基称为氧自由基（oxygen free radical，OFR）。主要包括超氧阴离子（
）和羟自由基（OH·）。生理情况下，98%的氧分子通过细胞色素氧化酶系统接受4个电子还原成水，同时释放能量，伴随少量自由基的生成。但也有1%～2%的氧接受一个电子生成
，或再接受一个电子生成H2O2，或者再接受一个电子生成OH·，氧自由基生成的反应式为：
可在Cu2+或Fe2+的催化下与H2O2反应生成OH·，这种反应称为Fenton反应。氧自由基与多价不饱和脂肪酸作用后生成的中间代谢产物称为脂性自由基，如烷自由基（L·）、烷氧自由基（LO·）、烷过氧自由基（LOO·）等。其他自由基还包括氯自由基（Cl·）、甲基自由基（CH3·）、一氧化氮自由基（NO·）等。NO·是一种气体自由基，本身是一种弱氧化剂，与
反应后生成过氧亚硝基阴离子（ONOO-），ONOO-不是自由基，但具有很强的氧化能力而产生损伤效应。这种由氮形成，并在分子组成上含有氮的一类化学性质非常活泼的物质，称为活性氮（reactive nitrogen species，RNS）。主要是指一氧化氮自由基（NO·）和过氧亚硝基阴离子（ONOO-）。
活性氧（reactive oxygen species，ROS）是指由氧生成的、具有比较强的氧化和还原性质的含氧代谢物，主要包含氧自由基，如超氧阴离子（
）、羟自由基（OH·）和非自由基的含氧衍生物如过氧化氢（H2O2）。过多的ROS会对细胞产生毒性，引起细胞的衰老和凋亡。许多疾病如动脉粥样硬化、心力衰竭、高血压、糖尿病、帕金森病和衰老等，都与ROS产生过多有关。但是低水平的ROS可作为许多刺激因子的第二信使，参与调节细胞的迁移、增殖、黏附、分化等多种生理功能。NADPH氧化酶是细胞产生ROS的主要来源之一。NADPH氧化酶主要由跨膜结构（Nox和p22phox）和胞质成分（p47phox，p67phox，p40phox及Rac1）组成。近年来研究发现，烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸（还原型）（NADPH）氧化酶来源的ROS参与调控细胞的多种功能。通过在细胞中加入荧光染料双氢乙啡啶（dihydroethidium，DHE）或者2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCF-DA）检测荧光值，可以反映细胞内活性氧的含量。
生理情况下，细胞内存在的抗氧化物质可以及时清除自由基，使自由基的生成与降解处于动态平衡，对机体并无毒害作用。但是在病理情况下，由于自由基或活性氧产生过多，或抗氧化酶类活性下降，可引发氧化应激（oxidative stress）反应损伤细胞，甚至引起细胞死亡。
（二）缺血-再灌注时自由基生成增多的机制
1.中性粒细胞NADPH氧化酶激活 在缺血组织可发现大量中性粒细胞浸润。组织缺血后，细胞释放白三烯和补体C3片段等。这些物质具有很强的趋化活性，可吸引大量中性粒细胞聚集并激活。中性粒细胞聚集有利于清除机体坏死细胞。缺血引起中性粒细胞上的NADPH氧化酶激活，氧在其催化下，接受电子形成氧自由基，用以杀灭病原微生物（图10-1）。当氧自由基生成过多或清除自由基的酶活性不足或抗氧化剂不足时，中性粒细胞产生的自由基可造成一定程度的组织损伤。再灌注期间组织重新获得O2，激活的中性粒细胞耗氧量显著增加，产生大量氧自由基，即呼吸爆发（respiratory burst）或氧爆发（oxygen burst），而进一步造成组织细胞的损伤。
图10-1 中性粒细胞NADPH氧化酶激活在自由基生成增多中的作用NADP+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化型）
2.线粒体内单电子还原生成氧自由基增多 正常情况下，线粒体内仅有1%～2%的氧经单电子还原为
。组织细胞缺氧使呼吸链传递电子的效能下降，导致进入细胞内的氧经4价还原形成的水减少，而经单电子还原而形成的氧自由基增多。再灌注时提供大量的氧，而线粒体呼吸链上的细胞色素氧化酶活性不能迅速增强，故线粒体是再灌注时氧自由基产生增多的一个主要来源。
3.黄嘌呤氧化酶形成增多 黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）及其前身黄嘌呤脱氢酶（xanthine dehydrogenase，XD）主要存在于毛细血管内皮细胞内。生理条件下，90%以XD的形式存在，XO仅为10%。缺血时，ATP含量降低，离子泵功能受损，细胞内Ca2+超载，激活Ca2+依赖性蛋白水解酶使XD大量转化为XO；同时，由于氧分压降低，ATP依次降解为ADP、AMP和次黄嘌呤，导致缺血组织内次黄嘌呤大量堆积。再灌注时提供了大量的氧，分子氧随血液进入缺血组织，在XO的催化下，缺血时积聚的次黄嘌呤转变为黄嘌呤，黄嘌呤再在XO的作用下生成尿酸。这两个过程均有电子释放。分子氧接受电子后产生
和H2O2，H2O2再在金属离子参与下形成更为活跃的OH·。因此，再灌注时组织内
、OH·、H2O2等活性氧产生增加（图10-2）。(https://www.daowen.com)
图10-2 黄嘌呤氧化酶在自由基生成增多中的作用
正常情况下，人、猪及兔体内的黄嘌呤氧化酶含量较低，再灌注期间不足以引起大量活性氧的生成。
4.儿茶酚胺自氧化增加 缺氧的条件下，交感-肾上腺髓质系统激活，分泌大量的儿茶酚胺，具有重要的代偿调节作用。但过多的儿茶酚胺往往成为对机体的有害因素。造成细胞损害的是儿茶酚胺的氧化产物，因为儿茶酚胺的氧化能产生具有细胞毒性的氧自由基。
5.琥珀酸选择性积聚 最近研究发现琥珀酸选择性积聚也是导致缺血-再灌注期间线粒体大量释放活性氧的一个重要原因。琥珀酸（丁二酸）是细胞线粒体三羧酸循环中的一种代谢中间产物。缺血导致琥珀酸积聚首先是因为琥珀酸脱氢酶逆转，该效应是因为ATP产生障碍引起嘌呤核苷酸循环、苹果酸/天冬氨酸穿梭翻转导致延胡索酸过量。在再灌注期间，积聚的琥珀酸迅速被琥珀酸氢化酶催化氧化，线粒体电子传递链复合物Ⅰ被抑制导致大量活性氧产生。
（三）自由基引起缺血-再灌注损伤的机制
缺血-再灌注时，大量产生的自由基可与各种细胞成分，如膜磷脂、蛋白质、核酸等发生反应，造成细胞损伤。
1.膜脂质过氧化 膜脂质微环境的稳定可保证膜结构完整和膜蛋白功能正常。缺血-再灌注时形成大量的自由基，可引发生物膜（细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜和内质网膜）多价不饱和脂肪酸断裂，发生膜脂质过氧化（lipid peroxidation）反应，造成多种损害。溶酶体膜受损，释放溶酶体酶，导致细胞结构破坏。线粒体膜受损，引起线粒体结构功能障碍，ATP生成减少，加重细胞能量代谢障碍。肌浆网膜受损，Ca2+-ATP酶活性降低使肌浆网摄取钙减少，导致细胞内钙超载。通过检测脂质过氧化产物丙二醛的含量可以反映脂质过氧化的程度。
2.蛋白质功能受损 自由基可使细胞结构蛋白和酶变性、聚合、降解或肽链断裂；自由基使得细胞结构蛋白和酶的巯基氧化形成二硫键；同时氧化氨基酸残基，胞质及膜蛋白和某些酶交联形成二聚体或更大的聚合物，蛋白质的功能直接受损。例如，肌纤维蛋白的损伤引起心肌收缩力减弱；肌浆网钙转运蛋白的受损可导致钙调节功能异常。丙二醛是重要的交联因子，可促进核酸、蛋白质及磷脂的交联，改变生物大分子的功能。
3.破坏核酸及染色体 造成DNA损伤的自由基主要是OH·。自由基使得染色体畸变、核酸碱基修饰、DNA断裂或交联，进而对细胞产生毒性作用。
4.细胞内钙超载 自由基可使Ca2+内流增加，Ca2+的排出减少，导致细胞内Ca2+超载，成为细胞致死的原因。Ca2+内流增加是由于细胞膜脂质过氧化，通透性增加；Ca2+的排出减少是由于ATP生产减少，使质膜和肌浆网钙泵功能降低，不能将胞质内过多的钙泵出或摄入肌浆网。
5.诱导炎症介质产生 自由基通过脂质过氧化和细胞内钙超载，激活磷脂酶A2，使膜磷脂释放出花生四烯酸，导致前列环素、血栓素A2、白三烯等生成增多，加剧炎症反应。
总之，缺血-再灌注促进自由基的生成，自由基可导致细胞损伤，两者相互影响，促进再灌注损伤的发生和发展。因此，自由基生成增多是缺血-再灌注损伤极为重要的发病机制。