小动物高原缺氧脑损伤评价技术方法
1.运动协调功能
转棒实验可以用于检测大小鼠的运动协调性。大小鼠经低压低氧(模拟高原环境)处理后,小鼠神经功能受到影响,大小鼠协调性变差,更容易从转棒上掉下来,可以此来检测其运动协调性。
2.认知功能(学习、记忆、注意)
Morris水迷宫实验主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力。该测试广泛被应用于认知科学、药理学、毒理学、神经生物学等学科领域,尤其是学习与记忆的优选经典实验。低压低氧暴露后可影响实验动物的学习记忆,表现在学习阶段的逃避潜伏期延长。而在空间探索阶段,穿越平台次数、穿越目标象限时间百分比(或路径百分比)减少,以及第一次穿越平台的潜伏期时间延长。
新物体识别实验是利用动物先天对新物体有探索倾向的原理而建立的学习记忆测试方法。该方法具有让小鼠在自由活动状态下进行学习记忆测试的特点,能更近似地模拟人类的学习记忆行为。同时,通过新物体(形状、大小等)的灵活变换,该实验还允许测试动物长期或短期记忆机制的形成以及急性药物在特定阶段的记忆形成的影响评判。急性低压低氧处理的实验动物对新物体的接触次数减少,识别指数下降,提示实验组动物对新奇物体的探索欲望降低。
Lat迷宫实验,该实验主要通过给予大小鼠一个视觉空间注意目标,观察需要视觉空间注意任务中非选择性注意的水平。记录动物的直立和斜搭在墙上的频率则作为非选择性注意的水平。研究人员发现经急性低压低氧暴露1 d后的大鼠斜搭在墙上的次数明显减少,提示其注意力受到了损伤。
Y迷宫实验可应用于动物的辨别性学习、工作记忆和参考记忆的测试,主要实验方法有自发性交替反应、空间识别、主动回避反应。在Y迷宫测试中,低压低氧导致的实验动物学习记忆能力表现在正确反应率和主动回避反应率均下降。
3.情绪状态
旷场实验,也称开场实验或自发活动实验,是评价实验动物在新奇环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等,反映实验动物在陌生环境中的自主行为。低氧暴露小鼠在旷场实验显示自发活力降低,其总运动距离、跨格数和站立次数等指标显著低于对照组。
高架十字迷宫是另外一个特定的行为实验范式。迷宫包括两个开放臂和两个封闭(墙体遮蔽)臂。该试验利用动物对敞开环境的恐惧以及对新环境的探究特性之间的矛盾来考察动物的焦虑状态。焦虑程度高的动物比焦虑程度低的动物更倾向于在封闭臂内逗留更长的时间。低氧明显减少实验动物的总穿梭次数,降低进入闭合臂及开放臂的次数,同时增加了大鼠停留在闭合臂的时间。提示低氧应激没有影响动物的基本运动能力,低氧应激可以诱导成年雄性大鼠出现类焦虑样行为。(https://www.daowen.com)
4.脑血流检测
可用激光散斑血流成像仪检测脑血流的变化。
脑功能性磁共振成像(Functional magnetic resonance imaging,fMRI)可监测大脑各区域血氧水平依赖信号(Blood oxygen level dependent,BOLD)的相对变化,特定脑区中血氧水平依赖信号的强弱与同一时刻该区域神经元的活动度呈正相关,血氧水平依赖信号越强,该区域脑活动越活跃。fMRI也可以用于分析脑内核团与认知活动功能联系。
5.脑水肿
可检测脑干湿重比:分别称量大鼠脑的干、湿体重,计算脑含水量的变化。也可用脑影像如核磁共振成像检测。
6.神经炎症
实时定量PCR检测脑组织内炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平或ELISA方法检测组织裂解液炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6含量。
7.形态病理
HE染色是经典观察组织形态方法,Nissl染色是用碱性染料染色神经组织的一种方法。尼氏体是胞质中一种嗜碱性物质,广泛见于各种神经元,不同神经元中的尼氏体形状、大小和数量各有差异。尼氏体大而数量多,说明神经细胞合成蛋白质的功能较强;相反在神经细胞受到损伤时,尼氏小体的数量会减少甚至消失。研究发现,HE染色结果显示低压低氧会导致小鼠海马CA1区锥体细胞排列松散和固缩深染。药物改善组小鼠海马CA1区锥体细胞数量较多,排列相对紧密,少量或极少出现固缩深染。
8.神经元形态
可以用神经元的特异性标记分子如NeuN、MAP2等免疫荧光染色,也可用Thy-1-YFP转基因小鼠直接观察。Thy-1转基因小鼠在神经元表面黏附分子Thy-1基因的启动子后方构建了黄色荧光蛋白的基因,因此,在表达Thy-1的投射神经元中会有大量的黄色荧光蛋白表达,从而方便观察神经元的形态变化包括分支和树突棘的变化。
9.神经环路
研究人员可以利用光学手段调控特定神经元亚群(甚至单个神经元)的电活动,研究模拟高原低氧情况下神经环路的功能和潜在调控机制。光遗传结合钙离子成像技术,可以在生理调控的基础上实现实时观测神经元的响应活动,有助于从多个维度定位特定功能的神经元集群,进一步揭示其在神经环路中的具体作用。