miRNA的产生过程

与蛋白编码基因类似，miRNA基因编码的直接转录产物并不具备生物学功能。miRNA生物学效应的发挥需经历一系列的转录后加工程序。简而言之，动物细胞内的miRNA基因由RNA聚合酶转录后，首先生成miRNA初始转录本，也称初级 miRNA（primarymiRNA，pri-miRNA）；随后，pri-miRNA还需要经历两次剪切，分别生成miRNA前体—也称次级 miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA）—和成熟的miRNA，直至其发挥作用。

1.miRNA的转录

RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，pol Ⅱ）和RNA聚合酶Ⅲ（RNA polymerase Ⅲ，pol Ⅲ）均能够参与miRNA的转录。一般认为，差别在于pol Ⅱ通常能够转录较长的RNA片段，包括mRNA和部分非编码RNA，而pol Ⅲ通常只具备转录较短的非编码RNA片段的能力。较早的观点认为，基因间miRNA通常具备独立的启动子自行完成转录，而内含子miRNA通常与其宿主基因具有转录一致性。然而，最近有研究表明，内含子miRNA也存在独立的转录机制。Fujita等在研究miR-21时发现，pri-miR-21在293T细胞中的转录本长约3.5 kb，而在佛波酯处理的HL-60细胞中，其转录本长达4.5 kb，推测其使用了独立启动子。此外，Ozsolak等推测约1/3的内含子miRNA可能具备独立的启动子，而这些启动子通常远离其宿主基因的转录起始位点。

在pol Ⅱ的介导下，内含子miRNA基因可转录生成长度超过1000碱基对（kilobase，kb）的pri-miRNA，其通常具有与mRNA类似的5'端的帽子结构和3'端的多聚腺苷酸（polyA）尾，并能够形成多个茎-环样（stem-loop-like）或发卡样（hairpin-like）的RNA二级结构。Gruber等研究发现，与mRNA帽子结构复合物相互作用的Ars2蛋白同样能够影响某些pri-miRNA的加工过程，其中包括miR-21、let-7和miR-155等。目前对基因间miRNA基因转录的认识有限，有研究表明部分基因间miRNA基因也可转录生成pri-miRNA，并具有类似结构。Mahony等通过分析145个基因间miRNA的5'-UTR发现，这些序列较蛋白编码基因的5'-UTR更具保守性，推测可能含有增强子或沉默子的作用位点。(https://www.daowen.com)

2.miRNA的成熟

在动物细胞内，miRNA的成熟过程通常需经历以下步骤：首先，pri-miRNA被加工成pre-miRNA。pri-miRNA在细胞核内的加工主要由Ⅱ型RNA核酸内切酶 Drosha和含双链RNA结合结构域的DGCR8组成的微处理器复合体（microprocessor）完成。DGCR8能够特异性识别双链中茎-环结构与单链间的链接部位，并指导Drosha 切割 pri-miRNA生成约长度70 nt的不含单链的茎-环结构，即pre-miRNA。Han等发现 Drosha和DGCR8存在转录后水平的交互反馈调控：DGCR8通过蛋白间相互作用稳定Drosha的蛋白，而Drosha可稳定DGCR8的mRNA。此外，DEAD盒蛋白家族的ATP依赖性RNA解旋酶p68、p72，核糖核蛋白复合物及核因子等也在该复合体中发挥着重要的功能。内源性的p68和p72能促进 Drosha对pri-miRNA的加工。Fukuda等在小鼠胚胎中发现，p72和p68缺失可导致成熟miRNA的水平降低。Drosha和p68还可通过与细胞内某些蛋白相互作用，调控primiRNA的生成加工过程。Suzuki等发现在DNA受损的条件下，野生型p53能够协同p68促进Drosha对某些pri-miRNA的加工，如 pri-miR-16-1、 pri-miR-143和pri-miR-145；突变型p53不能招募Drosha，反而会阻止微处理器复合体的形成。此外，有研究指出，某些miRNA的生成加工过程并不依赖于Drosha，如：内含子miRNA中的一个称为mirtron的亚型，其通常具有潜在的发卡结构，能够直接形成pre-miRNA 发卡结构而不依赖于微处理器复合体；某些内源性的小核仁RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）也能够直接生成包含两个类似pre-miRNA发卡结构的转录物，其中一个发卡结构可生成miRNA；另外，某些病毒miRNA前体也是不经Drosha途径产生pre-miRNA的直接来源。

其次，pre-miRNA生成后，核孔复合体中的Exportin-5通过Ran-GTP依赖机制将premiRNA从细胞核转运至细胞质。在细胞核内，Ran-GTP浓度较高，Exportin-5与Ran-GTP相结合，识别pre-miRNA的双链和3'端，促使其从Drosha中解离，并通过核孔复合体。Exportin-5携带 pre-miRNA进入细胞质后，Ran-GTP被水解为Ran-GDP，从而释放出premiRNA。目前对pre-miRNA出核的机制认识有限，但有证据显示这一过程受到严密调控。pre-miR-31在胰腺癌细胞系HS766T中能够正常转运出核，而其却在乳腺癌细胞系MCF7的细胞核聚集，提示其出核的过程在不同细胞类型中受到的调控方式也不同。

最后，pre-miRNA在细胞质中需进一步被加工成为成熟的miRNA。在细胞质中，另一个Ⅱ型RNA核酸内切酶Dicer负责pre-miRNA的第二次加工。Dicer具有多个结构域，包括两个纵列的Ⅰ型RNA酶结构域、一个ATP结合结构域和一个双链RNA结合结构域。Dicer可以识别Drosha切割产物的末端序列，并定位第二次切割位点，将具有茎-环结构的稳定pre-miRNA切割成一个不稳定的长度约22 nt的双链miRNA，即miRNA/miRNA结构。这种双链miRNA结构可选择性地与Ago蛋白（Argonaute）家族成员之一结合，并与TAR RNA结合蛋白和PKR蛋白激活因子等共同组成miRNA诱导的沉默复合体（miRNA-induced silencing complexes， miRISC）。通常，在miRNA/miRNA所形成的双链中，其中5’末端碱基配对稳定性较低的一条链被保留，成为成熟体miRNA；另一条链则被迅速降解。但近年研究显示，一些miRNA可在细胞内稳定存在，并具有相应的调控功能。另外，pre-miRNA加工还存在不依赖Dicer的其他途径。研究表明，pre-miR-451可在核内折叠形成较为特殊的二级结构，这一结构能被Ago2直接识别并切割加工成为成熟的miRNA。