二、红景天
红景天为景天科红景天属植物，《中华人民共和国药典》收录大花红景天Rhodiola crenulata（Hook. f. et Thoms.）H. Ohba作为基原，入药部位为根及根茎；性平，味甘、苦，归肺、心经；具有益气活血、通脉平喘的功效；用于气虚血瘀、胸痹心痛、中风偏瘫、倦怠气喘等症的治疗。红景天是藏医常用药材，藏语称为苏罗玛保，有“高原人参”“东方神草”“雪山仙草”等称号。现代研究证实：红景天能耐缺氧、抗辐射、抗疲劳，具有抗血栓形成，降低血液黏度，改善微循环，提高血氧饱和度和血氧分压，提高红细胞携氧能力，增加组织供氧，调节自由基代谢等功能。临床实践证实，以红景天为君药的复方（复方天棘胶囊、三普红景天胶囊、藏药多血康胶囊）治疗慢性高原病具有较好的效果。
青海省中医院长期致力于慢性高原病发病机制和防治方案研究，对红景天治疗慢性高原病药理、临床进行了较为系统的研究。通过建立大鼠慢性高原病模型，证实了灌胃给予红景天醇浸膏及其有效成分红景天苷可降低大鼠血清红细胞数、血红蛋白和红细胞比容，并对红景天防治慢性高原病的机制进行研究，主要开展了以下几方面的研究工作。
（一） 狭叶红景天防治慢性高原病的实验研究
1.材料与方法
（1）主要仪器。DZF-6090型真空干燥箱，嘉兴市中新医疗有限公司生产；高原空盒气压表，长春气象仪器厂生产；MDK-32OOAR型血流变系列测试分析仪，重庆市麦迪科技开发有限公司生产；迈瑞 BC-5500型五分类血液细胞分析仪，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。
（2）动物分组及模型建立。健康Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重（220±10）g，由青海省实验动物中心提供。实验前1周购进，安静环境，分笼饲养，温度（20±2）℃，相对湿度55%，自由摄入水食。随机分为空白对照组、模型组和实验高、中、小剂量组，每组8只。模型组和实验组按照姜平等［67］建立的方法复制慢性高原病大鼠疾病模型。
慢性高原病疾病模型的复制：选用健康大鼠，称重后分笼，置笼于高原环境模拟舱内。舱内置冰块3盒，且以减压缺氧法，模拟高原寒冷、缺氧的高原环境，舱内气温较室温下降（10.00±1.0）℃。关紧舱门，以真空泵进行减压，减压过程，需调节进风口的气流，以保持舱内有相对风速的新风。依据舱内高原空盒气压表所指示的海拔高度做阶梯式、间断性减压，即当指针移动的距离相当于升高海拔500 m的高度时便停止减压，休息10 min后，再做下一轮的减压，直至舱内气压下降至相当于海拔5000 m高度的气压为止。每天减压约6 h，动物离舱后灌服氯化钴（剂量为15 mg/kg，5 ml/kg）水溶液。周日为休息日。复制周期为40 d，模型建立成功。
（3）实验药品。狭叶红景天醇浸膏：狭叶红景天Rhodiola kirilowii（Regel）Maxim. 的根及根茎粉碎为粗粉，以50%乙醇冷浸提取3次，合并浸出液，减压回收乙醇，浓缩为稠膏，1 g膏相当于生药4 g。
（4）给药方法。实验组于模型建立开始的第15日按0.3 g/kg、0.6 g/kg、1.2 g/kg给狭叶红景天浸膏，连续20 d，空白对照组、模型组常规饲养。
（5）检测指标。于末次给药后第2日，经股动脉放血，肝素抗凝，测定RBC、HGB、HCT、血浆黏度和全血黏度。
（6）统计学方法。采用SPSS 17.0 for Windows统计软件，实验数据均采用平均数±标准差（
±s）表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD方法，P＜0.05为差异有显著的统计学意义，P＜0.01为差异有极显著的统计学意义。
2.结果
（1）狭叶红景天对慢性高原病大鼠RBC、HGB和HCT的影响如下（见表7-6）。
表7-6 狭叶红景天对慢性高原病大鼠RBC、HGB和HCT的影响（
± s）
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
狭叶红景天中、高剂量具有明显降低慢性高原病大鼠RBC、HGB和HCT的作用，并呈现较好的量效关系。
（2） 狭叶红景天对慢性高原病大鼠血液黏度的影响如下（见表7-7）。
表7-7 血液流变学检测结果（
± s）
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
狭叶红景天中、高剂量具有明显降低血浆黏度和全血黏度的作用（P＜0.05，P＜0.01）。
3.讨论
缺氧是慢性高原病发病的主要原因，血瘀是主要的临床表现。中医学认为慢性高原病是在高原缺氧环境引发气虚的基础上，气虚无力行血、行津，则产生血瘀、津停、痰凝的虚中夹实证，治疗应以益气化瘀为治则。狭叶红景天具有活血消肿、清热止咳、解热止痛、益气安神之功效，主治水土不服所致恶心、呕吐，嘴唇发紫，全身无力，胸闷难于透气，体虚无力，失眠多梦等症。现代药理研究发现，狭叶红景天具有提高常压缺氧、减压缺氧、中毒性缺氧、窒息性缺氧的能力，提高机体组织对氧的利用率，对脑部缺氧有一定的保护作用。研究发现狭叶红景天能够防止高原缺氧环境对甲皱微循环的不利影响，抑制大鼠进入高原后血浆、心、肝、脾中血栓素B2的升高，6-酮-前列腺素F1α含量的降低，显示具有活血化瘀的作用。
本实验结果显示，狭叶红景天能够降低慢性高原病大鼠RBC、HGB、HCT和血液黏度，推测在模型建立中期，大鼠给予狭叶红景天可以对抗外环境的缺氧状态，使机体缺氧程度减轻，从而抑制了RBC的过度增生，HGB、HCT和血液黏度也不再升高，体现狭叶红景天抗缺氧的药理作用。由于狭叶红景天还具有活血化瘀的作用，可使在模型建立的前期造成的血瘀状况得以治疗，二者综合作用，共同起到防治慢性高原病的作用。
（二） 红景天苷对慢性高原病大鼠防治作用的实验研究
1.实验材料
（1）实验动物。清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体重（220±20）g，由兰州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（甘）2012-0033。
（2）受试药物。红景天苷，成都恒基医药科技有限公司生产，批号：20130412；川芎嗪注射液，上海现代哈森药业有限公司生产，批号：20110412。
（3）主要试剂。大鼠血管内皮生长因子（VEGF）酶联免疫检测试剂盒、ET试剂盒，解放军总医院科技开发中心放免研究所；NO试剂盒、NOS试剂盒，南京建成生物研究所。
（4）主要仪器。UV-210型紫外分光光度仪，日本SHIMADZU公司；TL05型离心机，北京大恒建海科茂公司；BS2-l型电热三用水箱，北京医疗设备厂；MVlS-2015全自动血流变仪。
2.方法
（1）实验分组及模型建立。48只大鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组，以及红景天苷高、中、低剂量组和阳性药组，每组8只。除空白组外，其余5组按照姜平等［67］建立慢性高原病模型的方法复制大鼠疾病模型。并同时注射相应的药物，阳性药组给予川芎嗪注射液，对照组注射等体积生理盐水，40 d后，股静脉取血，测定相关指标。
（2）统计学方法。采用SPSS 17.0 for Windows统计软件，实验数据采用平均数±标准差（
±s）表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD方法，P＜0.05认为差异有显著的统计学意义，P＜0.01认为差异有极显著的统计学意义。
3.实验结果
（1）红景天苷对慢性高原病大鼠RBC、HGB、HCT的影响如下（见表7-8）。
表7-8 红景天苷对慢性高原病大鼠RBC、HGB、HCT的影响（x ± s）
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
红景天苷高、中、低剂量与模型组比较有显著性差异，说明红景天苷具有降低慢性高原病大鼠RBC、HGB、HCT的作用。
（2） 红景天苷对慢性高原病大鼠血液黏度的影响如下（见表7-9）。
表7-9 红景天苷对慢性高原病大鼠血液流变学的影响（x ± s）
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
模型组大鼠血浆黏度、全血黏度与对照组比较显著升高，红景天苷高、中、低剂量具有降低全血黏度、血浆黏度的作用，尤其是高剂量组作用显著，并与模型组比较有显著性差异，说明红景天苷具有降低慢性高原病大鼠血浆黏度、全血黏度的作用。
（3）红景天苷对慢性高原病大鼠血管内皮细胞、血管活性物质的影响如下（见表7-10）。
表7-10 红景天苷对慢性高原病大鼠血管内皮细胞、血管活性物质的影响
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
模型组大鼠NO、NOS与对照组比较显著降低，ET-1、VEGF显著升高。红景天苷高剂量具有显著升高NO、NOS的作用，红景天苷高、中剂量具有显著降低ET-1的作用，红景天苷高剂量具有显著降低VEGF的作用。
4.讨论
早在《四部医典》即有红景天的药理作用的记载，随着科研技术的不断发展和提高，红景天中的主要成分也逐渐被确认，目前已明确的成分包括红景天苷、酪醇等，其中研究最多的就数红景天苷，近年研究证实，红景天苷对肾脏、心血管系统等器官及系统具有保护作用。红景天苷还可降低全血黏度，通过降低红细胞刚性和聚集性指数而使HCT和纤维蛋白原减少，对血小板聚集起到明显的抑制作用。红景天苷具有抗缺氧、抗疲劳、抗衰老和保护心血管的作用。研究发现，慢性高原病患者红细胞异常增多，血液黏度增大，血管内皮系统受到很大的损伤。本实验表明：红景天苷通过降低慢性高原病大鼠RBC、HGB、HCT、全血黏度、血浆黏度，使异常的血管内皮细胞、血管活性物质趋于正常，从而改善微循环，增加血液与组织的物质交换，提高机体对氧的利用率，在对慢性高原病的治疗中发挥作用。
（三） 红景天苷对慢性高原病大鼠耳郭微循环的影响
1.实验材料
（1）实验动物。清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体重（220±20）g，由兰州大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（甘）2012-0033。
（2）受试药物。红景天苷，成都恒基医药科技有限公司生产，批号：20130412；川芎嗪注射液，上海现代哈森药业有限公司生产，批号：20110412。
（3）实验仪器。多普勒激光微循环仪，LDF100C，Biopac systems；微循环图像分析仪，WXT-4型，徐州恒达光学电子仪器有限公司。
2.方法
（1）实验分组及模型建立。48只大鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组，以及红景天苷高、中、低剂量组和阳性药组，每组8只。除空白组外，其余5组按照姜平等［67］建立慢性高原病模型的方法复制大鼠疾病模型。并同时注射相应的药物，阳性药组给予川芎嗪注射液，对照组注射等体积生理盐水，40 d模型复制成功后，按0.3 ml/100 g腹腔注射10%水合氯醛麻醉，用多普勒微循环检测仪检测耳郭微循环血流量，并用微循环图像分析仪测耳郭微血管流速和管径。
（2）统计学方法。采用SPSS 17.0 for windows统计软件，实验数据均采用平均数±标准差（
±s）表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD方法，P＜0.05为差异有显著的统计学意义，P＜0.01为差异有极显著的统计学意义。
3.实验结果
（1）红景天苷对慢性高原病大鼠耳郭微循环血流量的影响如下（见表7-11）。
表7-11 红景天苷对慢性高原病大鼠耳郭微循环血流量的影响（
± s）
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
模型组大鼠耳郭微循环血流量与对照组比较，血流量明显下降；红景天苷高、中、低剂量组血流量升高，并与模型组比较有显著性差异。说明红景天苷具有改善慢性高原病大鼠耳郭微循环障碍，增加耳郭微循环血流量的作用。
（2）红景天苷对慢性高原病大鼠耳郭微血管流速和管径的影响如下（见表7-12、表7-13）。
表7-12 红景天苷对慢性高原病大鼠耳郭微血管流速的影响（
± s）
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
模型组大鼠耳郭微动脉、微静脉血液流速明显降低，红景天苷高、中、低剂量组微动脉、微静脉血液流速明显加快，并与模型组比较有显著差异。说明红景天苷具有改善慢性高原病大鼠耳郭微动脉、微静脉血液流速的作用。
表7-13 红景天苷对慢性高原病大鼠耳郭微血管管径的影响（
± s）
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
模型组大鼠耳郭微动脉、微静脉血管直径变窄，红景天苷高、中、低剂量具有扩张微动脉、微静脉的作用，并与模型组比较有显著性差异，具有改善慢性高原病大鼠耳郭微动脉、微静脉变窄的作用。
4.讨论
资料显示，慢性高原病患者存在微循环功能障碍。微循环是微动脉和微静脉之间的血液循环，是血液与组织细胞进行物质交换的场所。现代医学认为，微循环直接参与细胞、组织的物质、能量、信息传递。微循环功能下降，机体从血液中获得氧及营养物质的能力降低，组织缺氧，刺激机体产生更多的红细胞，使血液变得更加黏稠，又加重了微循环障碍，如此往复，机体陷入“缺氧—红细胞增多—微循环障碍—血液同组织间物质交换能力下降—机体缺氧—红细胞增多”的恶性循环之中，使慢性高原病病情越来越重。
耳郭微循环是微循环的重要组成部分，由于位置表浅、微血管形态清晰、易于观察、对动物没有损伤而被广泛运用。微血管形态、口径和血流速度能够直接反应微循环的状态，进而可以了解血液在组织中的灌注情况。本实验结果显示红景天苷通过扩张慢性高原病大鼠耳郭微循环中微动脉、微静脉，加快血流速度，增加耳廓微循环中的血流量，降低RBC、HGB、HCT，降低全血黏度、血浆黏度，使异常的血管内皮细胞、血管活性物质趋于正常，从而改善微循环，增加血液与组织的物质交换，提高机体对氧的利用率，在对慢性高原病的治疗中发挥作用。
（四）红景天苷对慢性高原病大鼠促红细胞生成素及骨髓病理学的影响研究
通过研究不同剂量红景天苷（见图7-1）干预对慢性高原病大鼠EPO水平及骨髓红细胞形态的变化情况，探讨红景天苷防治慢性高原病的潜在机制，进而为慢性高原病的防治提供科学依据。
图7-1 红景天苷的化学结构
1.实验材料
（1）实验动物。SPF级Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重（220±20）g，由斯贝特（北京）生物技术有限公司实验动物中心提供。动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0002；实验动物饲养环境为恒温恒湿，自由饮水、饮食。
（2）受试药物。红景天苷纯度＞95%，成都恒基医药科技有限公司，生产批号：20170512。
（3）实验仪器。UPG-764双光束紫外分光光度计，北京优普通用科技有限公司；BX5353+DP27奥林巴斯显微镜及成像系统；伯乐蛋白电泳仪、全自动凝胶成像分析系统，美国伯乐Bio-Rad公司。
2.方法
（1）实验分组及模型建立。40只大鼠随机分为对照组、慢性高原病模型组及红景天苷高、中、低剂量组，每组各8只。除对照组外，其余4组按照姜平等［67］慢性高原病大鼠疾病模型的复制方法建立大鼠模型。除模型组和空白对照组分别灌胃等体积生理盐水外，其余各组分别灌胃给药红景天苷高（200 mg/kg）、中（100 mg/kg）、低（50 mg/kg）剂量，每日1次，40 d模型复制成功后，股动脉取血，取肾脏组织，分别测定EPO水平；并取大鼠骨髓液进行病理观察。
（2）样本。股动脉采血4～5 ml至肝素化的冷凝管；解剖取出肾皮质均匀分成5份，其中3份冻存检测生化指标用，剩下2份分别固定在甲醛和戊二醛中，以供病理观察。
（3）血清EPO水平测定方法。采集血样静置30 min后3000 r/min离心20 min分离血清，置于-80℃冰箱保存待测，通过ELISA法检测。
（4）肾脏EPO水平测定方法。Western Blot实验以每孔30 μg的样品量进行电泳，EPO抗体（1∶1000）孵育后加二抗（1∶3000），ECL发光检测，Image J软件分析。
（5）骨髓病理学观察。骨髓病理涂片，即摘取各组大鼠股骨骨髓至载玻片上，用推片蘸取骨髓小粒丰富的骨髓液少许（直径1～2 mm大小的骨髓液1滴），置于载玻片右端1/3处，使推片、玻片和骨髓液接触后骨髓液扩散成一均匀的粗线，然后使推片和玻片成30°～45°，自右向左，均匀地向前推，保证涂片头、体、尾完整，自然晾干，进行石蜡包埋、切片，HE染色后显微镜观察骨髓细胞形态。骨髓病理显微观察，即在显微镜下观察骨髓象变化，计数500个细胞，分类计数红细胞数和粒细胞数，计算红细胞比例、粒细胞比例及粒红细胞比。
（6）统计学方法。采用SPSS 17.0软件进行处理分析，数据均采用平均数±标准差（
±s）表示，多组之间比较采用单因素方差分析，组间差异比较用q检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
3.实验结果
（1）红景天苷对慢性高原病大鼠EPO水平的影响。本研究通过Western Blot及ELISA实验分别检测各组大鼠肾脏和血液中的EPO水平。结果显示，与正常对照组相比，慢性高原病模型大鼠肾脏及血中的EPO水平均显著升高（P＜0.01），提示肾脏和血中EPO水平升高是慢性高原病大鼠的显著特征。与慢性高原病模型组相比，红景天苷高、中、低剂量治疗40 d后，大鼠的肾脏EPO、血清EPO水平均有显著下调，且具有统计学差异（P＜0.01）（见表7-14、图7-2）。尤其是血清EPO水平的下调呈显著的剂量依赖性。上述研究提示红景天苷干预后可显著回调肾脏EPO、血清的EPO水平。(https://www.daowen.com)
表7-14 红景天苷对慢性高原病大鼠EPO水平的影响（
± s，n=8）
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
图7-2 红景天苷干预对慢性高原病大鼠肾脏EPO水平的影响
EPO：促红细胞生成素；GAPDH：3-磷酸脱氢酶
（2）骨髓象变化。空白对照大鼠的骨髓象有核红细胞和粒细胞比例正常，成熟红细胞形态一致，未见骨髓红细胞系增生改变；而慢性高原病模型大鼠骨髓象成熟红细胞明显增多，成熟红细胞形态不一致，且有明显差异。与空白对照大鼠骨髓象比较，模型大鼠有核红细胞增生明显，尤其是以晚幼粒红细胞增多为甚，有核红细胞比例显著增高。低剂量治疗大鼠骨髓象红细胞系增生活跃，主要是晚幼红细胞增生活跃，与模型大鼠骨髓象比较没有明显形态学变化，差异无统计学意义；中剂量治疗大鼠骨髓象虽然有红细胞系增生，但晚幼红细胞和成熟红细胞增生并不明显，且成熟红细胞形态正常。高剂量治疗骨髓象粒细胞系和红细胞系比例趋于正常，与模型组骨髓象比较，晚幼红细胞增生并不活跃，成熟红细胞形态正常（见图7-3、表7-15）。
图7-3 各组大鼠骨髓病理观察图
表7-15 红景天苷慢性高原病大鼠骨髓象的影响（
± s）
注：与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
4.讨论
EPO主要来源于肾皮质内肾小管周围细胞，其次是肝脏、骨髓及脾脏中的巨噬细胞。久居高原缺氧环境中的人群，肾脏因持续低氧激活磷脂酶并诱发环磷酸腺苷增加，磷脂酶进一步刺激前列腺素PG1、PG2分泌，激活蛋白激酶；蛋白激酶及环磷酸腺苷在水解酶加磷氧基的作用下合成EPO。EPO调节骨髓，使HSC向红系增生、分化、成熟，进而使血液中的血红蛋白（HGB）水平升高，适应缺氧环境。但是肾皮质内EPO生成需要消耗氧气，使肾皮质缺氧进一步增加，形成“缺氧—EPO分泌增加—红系增生—加重缺氧”的恶性循环。严重的低氧血症又会促进红系增生，引发血液黏度升高，最终形成“缺氧—红系增生—血液黏滞—缺氧加重”的恶性循环。由此可见，EPO的分泌过度可能是诱发慢性高原病的重要因素。
慢性高原病组血浆EPO水平显著高于正常对照组，且移居者高于世居者，更比平原对照组明显升高。EPO通过作用于靶细胞上的EPOR，不仅能刺激骨髓多能干细胞向RBC系列转化，促进红系原始细胞增殖、缩短RBC成熟时间，进而使骨髓中网织RBC释放增加，最终诱导外周血中成熟RBC数量增加。此外，慢性高原病患者血浆EPO水平明显高于平原健康对照组，且与外周血中HGB水平存在明显正相关。
研究结果显示，慢性高原病大鼠肾脏EPO、血浆EPO水平均有显著升高，但是红景天苷高、中、低剂量干预40 d后均有显著降低慢性高原病大鼠EPO水平的效果，提示红景天苷可能是通过降低慢性高原病大鼠体内EPO过度分泌、合成与释放，外周血中成熟RBC过度代偿性增生数量减少，从而降低血液黏度，使血流加速、氧传递畅通，改善组织缺氧。
骨髓涂片是评价造血系统的重要方法，该技术常用于判断待测药物的潜在血液毒性及对造血系统的影响。本研究中，骨髓细胞病理学研究结果显示慢性高原病大鼠的骨髓未成熟红细胞明显增多，尤其以变形红细胞最为突显；细胞分类计数后，发现中、晚幼红细胞明显增加，粒细胞系统与有核红细胞的比值明显降低，红细胞系统增生活跃，细胞间接和直接分裂的频率增加，红系的病态造血，导致骨髓生成、释放调节均失控，从而使红细胞增多，骨髓造血功能发生异常，进而诱发慢性高原病。但红景天苷高剂量干预后的大鼠骨髓象粒细胞系和红细胞系比例趋于正常，且与模型组骨髓象比较，晚幼红细胞增生稳定，成熟红细胞形态正常。提示红景天苷具有改善慢性高原病大鼠骨髓象红细胞系过度代偿性增生的作用。
（五）红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞膜结构和功能的影响研究
1.实验材料
（1）实验动物。SPF级Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重（220±20）g，由斯贝特（北京）生物技术有限公司实验动物中心提供。动物质量合格证号：SCXK（京）2016-0002；实验动物饲养环境为室温20～22℃，自由饮水，饲固体饲料。
（2）受试药物。红景天苷，纯度＞95%，成都恒基医药科技有限公司生产，批号：20170512。
（3）主要试剂。红细胞膜流动性TMA-DPH荧光检测试剂盒，HR0954，北京百奥莱博科技有限公司生产；总胆固醇测定试剂盒（单试剂GPO-PAP法）、超微量Na+-K+-ATP酶测定试剂盒、超微量ATP酶测试盒（Na+-K+、Ca2+-Mg2+-ATP酶）、钙测试盒、钠测试盒，A111-1-1、A070-2-2、A070-5-1、C002、C004-2，南京建成生物工程研究所；磷脂检测试剂盒，MAK122-1KT，Sigma-Aldrich；磷脂酸（PA）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）ELISA检测试剂盒，CK-E92986R、CK-E30695R、CKE30963R、CK-E30694R，上海源叶生物科技有限公司。
（4）主要仪器。FL970天美荧光分光光度计，广州贝拓科学技术有限公司；Alpha-1106型可见分光光度计，上海谱元仪器有限公司；酶标仪，赛默飞世尔科技中国有限公司；恒温循环器HX-10555和台式高速冷冻离心机TLL-C，北京四环科学仪器厂。
2.方法
（1）药物配制。红景天苷溶液配置：分别取2.0 g、1.0 g、0.5 g红景天苷溶于生理盐水定容于100 ml，配置不同浓度的红景天苷溶液并低温避光保存。
（2）动物分组及给药。将40只大鼠每组8只，随机分为5组，雌雄各半，分开饲养。分别为正常对照组、慢性高原病模型组及红景天苷高剂量组（200 mg/kg）、中剂量组（100 mg/kg）、低剂量组（50 mg/kg）。除正常对照组外，其余4组按照姜平等人［67］慢性高原病大鼠疾病模型的复制方法建立大鼠疾病模型。红景天苷组分别灌胃给予不同剂量的药物，慢性高原病模型组和正常对照组按体重灌胃等体积生理盐水。每组给药体积均为10 ml/kg，每日1次，连续40 d。
（3）采集血液样本。取血前各组大鼠禁食不禁水，于末次给药后，腹腔注射乌拉坦进行麻醉，仰卧于手术台上股总动脉采血，股动脉收集血液标本4～5 ml，将血液标本收集到已肝素化的冷凝管，测定各项指标和用于制备红细胞膜。
（4）红细胞膜的制备。运用低渗溶解和差速离心法。将收集的血液标本，以3000 r/min离心10 min，弃上清液，除去的主要为白细胞和血小板的中间层，再以1∶3比例加入等渗的pH值为7.4的缓冲液（PBS），以3000 r/min离心10 min，弃上清液，反复洗涤3次，直至上清液无色，轻轻吸除上清液，得到压积红细胞混悬液1.5～2.5 ml。取0.5 ml压积红细胞，向红细胞混悬液中以1∶10比例加入预冷的5 mmol/L pH值为7.4 Tris-HCl低渗溶液，同时加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）0.1 mmol/L，放入4℃冰箱中溶血过夜，将所得红细胞溶血液以3000 r/min离心10 min，弃上清液，再加入5 mmol/L pH值为7.4 Tris-HCl低渗溶液，以3000 r/min离心10 min，反复洗涤3次，最后得到乳白色膜或粉红色血影膜样品，将其1∶1悬浮在PBS溶液中，用蛋白试剂盒定量膜蛋白，最后放置-80℃冰箱备用。
（5）相关生化指标的测定方法。①红细胞膜脂质流动性的测定：取红细胞膜混悬液，加2 ml 2.0 μmol/L 1， 6-二苯基-1， 3， 5-乙三烯（DPH）作荧光探针，37℃孵育 30 min，加入pH值为7.4的10 mmol/L缓冲液（PBS），离心洗涤2次，除去标记液。离心条件为0～4℃下4000 r/min离心10 min。PBS重悬样品，上机检测偏振度。检测条件为激发波长362 nm，发射波长432 nm，激发狭缝5 nm，发射狭缝 10 nm。检测激发光光轴呈水平方向的水平、垂直方向的荧光强度，激发光光轴呈垂直方向时水平、垂直方向的荧光强度。根据Einsteins硬粒子溶液黏度公式计算细胞膜脂质流动度（MF）。MF=（ρmax/ρ-1）/ρ（ρ，荧光偏振度的测定值；ρmax=0.5）。②红细胞膜总胆固醇含量（单位为μmol/mg）的测定：在提取好的红细胞膜中加入0.2～0.3 ml的匀浆介质进行匀浆，冰水浴条件下手动匀浆，制备好的匀浆液不离心，混匀，37℃孵育10 min，在波长510 nm处用酶标仪测定各样品吸光度值。③红细胞膜总磷脂含量（单位为μmol/mg）测定：取红细胞膜顺次加入无水甲醇和氯仿，振荡混匀，加H2O离心，离心条件2000 r/min，离心时间5 min，取下层液体重复离心1次；取下层液加入亚硫酸钠（Na2SO3），过滤，滤液干燥。加氯仿溶解，加2倍体积高氯酸在消化炉上消化至淡黄色，加过氧化氢（H2O2），加热至无色冷却，加少量H2O，100℃加热10 min后冷却至室温，按磷含量检测试剂盒说明操作，检测吸光度值，结合蛋白定量计算红细胞膜磷脂含量。④红细胞膜磷脂成分（单位为μmol/mg）的测定：红细胞膜磷脂的提取，即取红细胞膜加入无水甲醇，混匀，加入氯仿后在漩涡混匀器上剧烈振荡2 min，再加1 ml氯仿振荡1 min，加去离子水振摇1 min，2000 r/min离心5 min，取底层液体重复1次；取底层液体加入少量的Na2SO3，振荡，过滤，收集滤液，真空干燥，密封后存于-20℃待测。磷脂的消化，即取干燥后的膜样品，加少量氯仿溶解至消化瓶中，加入2倍体积的高氯酸消化，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑色转变成淡黄色，取下稍冷，加2滴H2O2，继续加热至溶液呈无色，冷却，加少量的水，于100℃时加热10 min，使焦磷酸转变为磷酸，冷至室温，待测。使用ELISA试剂盒测定磷脂成分PA、PC、PE、PS含量，参照检测试剂盒说明书在450 nm波长处用酶标仪测定各样品的吸光度（OD值）。按标准品线性回归曲线方程计算各样本浓度值。⑤红细胞膜Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性（单位为U/mg）的测定：采用化学比色法。取上述红细胞血影膜严格按照试剂盒提供的规范操作步骤进行检测，660 nm处测各管吸光度值。⑥红细胞内Na+和Ca2+浓度的测定：吸取0.5 ml压积红细胞于组织匀浆器中，匀浆后得到红细胞匀浆液，然后收集匀浆液离心后收集上清液，采用分光光度计检测，波长610 nm或620 nm，酶标仪比色，测各管吸光度值。
（6）数据分析及统计。采用SPSS 17.0 for windows统计软件，数据均采用平均数±标准差（
±s）表示，计量资料组间比较采用单因素方差分析、重复测量方差分析，多重比较采用LSD方法，P＜0.05认为差异有显著的统计学意义，P＜0.01认为差异有极显著的统计学意义。
3.实验结果
（1）红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞膜脂质流动性的影响（见图7-4）。慢性高原病模型组红细胞膜的脂质流动性（MF）显著低于正常对照组（P＜0.01），提示慢性高原病大鼠的红细胞膜脂质流动性较健康大鼠有明显降低。但红景天苷中、高剂量组可极显著改善慢性高原病大鼠红细胞膜的脂质流动性（P＜0.01）。研究发现慢性高原病患者的红细胞膜流动性下降，可能导致红细胞的变形能力降低和聚集性增加，血液黏度升高，使机体进一步缺氧。在本实验中红景天苷（尤其是中、高剂量组）可逆转红细胞膜脂质流动性的降低，提示红景天苷可通过调节红细胞膜脂质流动性去改善血液循环，进而达到促进供氧和缓解氧化疲劳的功效。
图7-4 红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞膜脂质流动性的影响（n=8）
C：正常对照组；M：慢性高原病模型组；HJTG-L：红景天苷低剂量组；HJTG-M：红景天苷中剂量组；HJTG-H：红景天苷高剂量组
注：与慢性高原病模型组比较，##P＜0.01。
图7-5 红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞膜总胆固醇（A）、总磷脂（B）含量的影响（n=8）
C：正常对照组；M：慢性高原病模型组；HJTG-L：红景天苷低剂量组；HJTG-M：红景天苷中剂量组；HJTG-H：红景天苷高剂量组
注：与慢性高原病模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
（2）红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞膜总胆固醇和总磷脂含量的影响（见图7-5）。慢性高原病模型组大鼠红细胞膜的总胆固醇含量明显高于正常对照组（P＜0.01），总磷脂含量明显低于正常对照组（P＜0.01），表明慢性高原病大鼠红细胞膜的总胆固醇含量升高、总磷脂含量降低。有研究也显示，慢性高原病患者红细胞膜胆固醇含量和胆固醇/磷脂比值显著升高，膜磷脂含量降低，并发现这与红细胞变形能力降低有密切关系，存在相关性。本研究中，在红景天苷干预后，中、高剂量治疗组大鼠红细胞膜总胆固醇含量极显著低于慢性高原病模型组（P＜0.01），高剂量组总磷脂含量显著高于慢性高原病模型组（P＜0.05），向健康大鼠的正常指标转变，提示红景天苷可通过降低慢性高原病大鼠红细胞膜总胆固醇含量，提高总磷脂含量，改善红细胞的变形能力，提高细胞膜的稳定性。
图7-6 红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞膜PA（A）、PC（B）、PE（C）和PS（D）含量的影响（n=8）
C：正常对照组；M：慢性高原病模型组；HJTG-L：红景天苷低剂量组；HJTG-M：红景天苷中剂量组；HJTG-H：红景天苷高剂量组
注：与慢性高原病模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
（3）红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞膜磷脂成分含量的影响（见图7-6）。慢性高原病模型组大鼠红细胞膜中磷脂成分PA、PC、PE和PS含量极显著低于正常对照组（P＜0.01），提示慢性高原病大鼠红细胞膜PA、PC、PE和PS含量较健康大鼠降低。Kamada T认为在红细胞膜脂质中，不同磷脂成分改变才是导致红细胞膜性能异常的主要原因。本研究中，红景天苷干预后，红景天苷低、中、高剂量治疗组大鼠红细胞膜PA、PC、PE含量明显高于慢性高原病模型组（P＜0.05或P＜0.01），红景天苷高剂量治疗组PS含量明显高于慢性高原病模型组（P＜0.01），提示红景天苷可提高慢性高原病大鼠红细胞膜PA、PC、PE和PS的含量，能改善红细胞膜异常结构和性能，对维持细胞膜稳态有重要作用。
（4）红景天苷干预对Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响（见图7-7）。结果表明，慢性高原病模型组红细胞膜Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性明显低于正常对照组（P＜0.01），提示慢性高原病大鼠红细胞膜Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性降低。这和邹春华等［68］研究发现慢性高原病患者红细胞膜的ATP酶活性明显低于正常人的情况一致，缺氧会导致细胞内线粒体受损，能量代谢紊乱，ATPase的功能失调，细胞膜离子转运障碍，进而影响相关的细胞物质交换、能量转换及信息传递等功能。但红景天苷干预后，大鼠红细胞膜Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性明显回调。红景天苷低、中、高剂量治疗组大鼠的红细胞膜Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性明显高于慢性高原病模型组（P＜0.05或P＜0.01），提示红景天苷可调控慢性高原病大鼠红细胞膜Na+-K+-ATPase酶和Ca2+-Mg2+-ATPase酶活性消减的程度，改善红细胞膜的功能和细胞代谢活动。
图7-7 红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞膜Na+-K+-ATPase（A）和Ca2+-Mg2+-ATPase（B）活性的影响（n=8）
C：正常对照组；M：慢性高原病模型组；HJTG-L：红景天苷低剂量组；HJTG-M：红景天苷中剂量组；HJTG-H：红景天苷高剂量组
注：与慢性高原病模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
（5）红景天苷干预对慢性高原病大鼠红细胞内Na+和Ca2+浓度的影响（见图7-8）。慢性高原病模型组红细胞内Na+和Ca2+浓度水平极显著高于正常对照组（P＜0.01），表明慢性高原病大鼠相较于健康大鼠，红细胞内Na+和Ca2+浓度升高。异常红细胞中，细胞内Na+增多，会使细胞内外渗透压失衡，红细胞脆性增加，寿命缩短；细胞内Ca2+浓度水平升高，影响膜蛋白之间的相互作用，使红细胞膜的黏弹性下降，膜脂质与骨架蛋白分离，导致细胞膜的稳定性和流动性下降，红细胞变形能力降低。本实验中，红景天苷干预后，红景天苷低、中、高剂量组慢性高原病大鼠红细胞内Na+和Ca2+的水平明显低于慢性高原病模型组（P＜0.05及P＜0.01），提示红景天苷通过显著降低慢性高原病大鼠红细胞内Na+和Ca2+浓度，维持细胞内外渗透压平衡，保护红细胞正常形态和功能，提高红细胞膜的稳定性和流动性。
图7-8 红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞内Na+（A）和Ca2+（B）浓度的影响（n=8）
C：正常对照组；M：慢性高原病模型组；HJTG-L：红景天苷低剂量组；HJTG-M：红景天苷中剂量组；HJTG-H：红景天苷高剂量组
注：与慢性高原病模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
4.讨论
红景天长期用于治疗高原病，其主要活性成分红景天苷，具有抗抑郁、抗焦虑、抗应激、抗疲劳、抗氧化、抗缺氧、抗衰老、改善人体造血功能、改善记忆、预防高原反应等药理活性。红景天苷还具有独特的双向调控作用和适应原性作用，能增强机体应对不同刺激的能力，使异常变化指标向正常转变。但红景天苷改善慢性高原病症状的分子机制尚不清楚。基于其药理作用，本实验对红景天苷在慢性高原病发生过程中对红细胞膜结构和功能的调控作用进行了深入研究。
慢性高原病发病与环境缺氧有密切关系，机体能量代谢异常，红细胞膜的结构发生变化，使红细胞膜的物理特性改变，而红细胞膜物理特性主要是红细胞膜的力学特性，其力学特性又取决于红细胞膜的结构。慢性高原病红细胞膜脂质的改变必将影响膜的流动性、通透性、渗透脆性，使膜分子动力学发生改变，进而影响细胞代谢活动。分析慢性高原病红细胞膜成分的改变，对从分子水平了解慢性高原病的细胞功能异常有重要价值。
红细胞膜组成中脂质约占50%，主要由磷脂和胆固醇组成，磷脂主要包括PA、PC、PE、PS等成分。在成熟红细胞膜中，磷脂在脂质双层的成分分布是不对称的，即PC主要位于膜的外层，PE的大部分及全部PS位于内层，这种不对称性对红细胞具有十分重要的意义。磷脂与红细胞的形态、物质转运、识别和清除等密切相关，还影响红细胞膜内蛋白的功能、血液的黏滞性和凝固性。胆固醇是红细胞膜脂质双层的重要组成部分，功能主要是为蛋白质提供结构骨架；维持膜的通透性，使细胞正常代谢；提高膜上脂质双层的机械稳定性；调节细胞膜的流动性和稳定性，在维持红细胞形态上起关键作用。
三磷酸腺苷酶（ATPase）广泛存在于细胞膜上，与细胞基本功能密切相关。正常细胞中，细胞内Na+浓度远低于细胞外，K+浓度远高于细胞外，这种梯度电位正是靠Na+-K+-ATPase水解释放能量来实现，即泵出细胞内的Na+并将细胞外K+转入细胞内，以维持细胞内外渗透压平衡，保护细胞内外离子浓度稳定。Ca2+-Mg2+-ATPase对维持膜脂质不对称分布有重要作用，并将细胞内Ca2+主动转送到细胞外，维持细胞内外极高的Ca2+浓度差，细胞的许多功能都依赖于这种浓度差，一旦降低，会导致细胞功能性损伤或死亡，而Mg2+是Na+泵和Ca2+泵的激动剂。因此Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase在维持细胞结构功能方面具有重要意义。
综上所述，本研究发现红景天苷可改善慢性高原病大鼠红细胞膜的脂质流动性，提示红景天苷可以改善血液循环，进而达到促进供氧和缓解氧化疲劳的功效。红景天苷还可显著提高红细胞膜总磷脂、PA、PC、PE、PS含量，增加Na+-K+-ATPase 和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性；降低总胆固醇的水平和红细胞内Na+、Ca2+的浓度，提示红景天苷可通过调节红细胞膜的脂质成分，维持红细胞膜的正常结构，改善红细胞膜的功能和细胞代谢活动，进而缓解慢性高原病相关症状。
（六）红景天苷干预前后慢性高原病大鼠红细胞膜的蛋白质组学研究
蛋白质组学是一种高通量筛选技术，在医学领域的应用主要是通过寻找与某些疾病相关特异性差异表达的蛋白质分子，进一步探寻与该疾病发生发展的相关分子机制，从而发现可能用于新药物设计的分子靶点，最终为该病的治疗提供一种新的选择。本研究采用双向凝胶电泳（Twodimensional electrophoresis，2-DE）和生物信息学等方法观察红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞膜蛋白质组学的影响，为进一步探索红景天苷改善慢性高原病的机制研究提供基础支持。
1.材料
（1）实验动物。选取健康清洁级成年Wistar大鼠16只，雌雄各半，分开饲养，体重为180～220 g，周龄为6周，由斯贝特（北京）生物技术有限公司实验动物中心提供，动物质量合格证号：SCXK（京）2016-0002。大鼠自由进食及饮水，室内保持通风，饲养环境温度为22～24 ℃，昼夜交替节律为12 h，避免强光及噪声刺激。动物分组采用随机原则，在进行处理前先适应环境1周。
（2）主要试剂及药品。三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS）、三氟乙酸四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、硫脲、碘乙酰胺、考马斯亮蓝G-250，Sigma公司；固相pH梯度胶条（pH值为3～10，NL），美国Bio-Rad公司；IPG Buffer pH 3-10、Protease Inhibitor、3-（胆酰胺丙基）-二乙胺丙磺酸（CHAPS）、二硫苏糖醇（DTT）、矿物油、甘氨酸和低熔点琼脂糖，北京索莱宝科技有限公司；快速银染试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；红景天苷（纯度＞95%；#20170512），成都恒基医药科技有限公司；其余药品均为国产分析纯试剂。
（3）主要仪器。Model iMark全自动酶标仪，美国Boi-Rad公司；Optima XL-100K超速冷冻离心机，美国Beckman coulter公司；Heto Lyo-lab 3000型冷冻干燥机，丹麦 Heto公司；Mini-PROTEAN Tetra cell系统、PROTEAN IEF Cell系统、PROTEANⅡXL Cell大型垂直电泳槽、GS-800校准型光密度扫描仪，PDQuest 8.0.1及Quantity One4.6.7凝胶图像分析软件，美国Bio-Rad公司；API4800串联飞行时间质谱仪MALDI-TOF-TOF，美国Applied Biosystems公司。
2.方法
（1）动物分组及给药。将16只大鼠随机分为2组，每组8只，雌雄各半，分开饲养，为慢性高原病模型组和红景天苷治疗组。红景天苷溶液配置：取1.0 g红景天苷溶于生理盐水定容于100 ml，配置浓度为10 mg/ml的红景天苷溶液，低温避光保存。按照姜平等［67］“慢性高原病大鼠疾病模型的复制”方法建立慢性高原病大鼠模型。治疗组灌胃给予100 mg/kg的红景天苷，慢性高原病模型组按体重灌胃等体积生理盐水。每组给药体积均为10 ml/kg，每日1次，连续40 d。
（2）采集血液样本。取血前各组大鼠禁食不禁水，于末次给药后，腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，仰卧于手术台上股总动脉采血，股动脉收集血液标本4～5 ml，将血液标本直接收集到已肝素化的冷凝管，测定各项指标及用于制备红细胞膜。
（3）红细胞膜的制备。用低渗溶解和差速离心法。将收集的血液标本，以3000 r/min离心10 min，弃上清液，除去主要为白细胞和血小板的中间层，再以1∶3比例加入等渗的pH值为7.4的缓冲液（PBS），以3000 r/min离心10 min，弃上清液，反复洗涤3次，直至上清液无色，轻轻吸除上清液，得到压积红细胞混悬液1.5～2.5 ml。取0.5 ml压积红细胞，向红细胞混悬液中以1∶10比例加入预冷的5 mmol/L pH值为7.4 Tris-HCl低渗溶液，同时加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）0.1 mmol/L，放入4℃冰箱中溶血过夜，将所得红细胞溶血液以3000 r/min离心10 min，弃上清液，再加入5 mmol/L pH值为7.4 Tris-HCl溶液以3000 r/min离心10 min，反复洗涤3次，最后得到乳白色膜或粉红色血影膜样品，即为红细胞膜，放置-80℃冰箱备用。
（4）红细胞膜总蛋白提取及纯化。将红细胞膜样品重悬于1 ml细胞裂解缓冲液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、40 mmol/L Tris、5 mmol/L PMSF、0.5% IPG buffer、Protease Inhibitor）中，在液氮中反复冻融3次后，加入5 mg/L Rnase、20 mg/L Dnase，以16000×g 4 ℃离心50 min，取上清液即为细胞总蛋白。Bradford法测定蛋白浓度，其余样品冻存于-80℃备用。
（5）双向电泳。参照Bio-Rad双向电泳指南和文献的改进方案进行，在聚焦盘中均匀加入含80 μg蛋白质样品的水化上样缓冲液（7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L DTT、0.5%两性电解质、0.001%溴酚蓝）280 μl，将胶条胶面朝下放入聚焦槽内，覆盖2.5 ml矿物油，然后将聚焦盘置于PROTEAN IEF Cell电泳仪中进行等电聚焦。胶条平衡30 min后进行220 V恒压SDS-PAGE电泳，凝胶固定后进行硝酸银染色。
（6）凝胶图像分析。凝胶通过透射扫描仪进行扫描获取图像，用PDQuest 8.0图像分析软件选择模型组作为参考胶，对凝胶图谱依次进行点检测、背景消减、标准化、匹配、建立平均凝胶，同时结合人工校正，对凝胶图像进行分析。以图谱中蛋白点相对变化量大于2倍为标准，检测具有明显差异的蛋白质点。
（7）差异蛋白质点的质谱鉴定。在凝胶上选取差异明显的蛋白点进行切胶、脱色、酶解、萃取等操作，制备样品。将样品放入质谱仪中进行分析，采用正离子和自动获取数据模式进行数据采集，选择强度最大的10个峰进行二级质谱分析，得到肽质量指纹图（PMF）；使用MascotDistiller 2.1软件和GPS 3.6软件得到的质谱数据，进行蛋白鉴定，数据库选择NCBI、物种分类选Rat sapiens；酶选Trypsin、允许的最大漏切位点选1、固定修饰选Carbamidomethyl、可变修饰选Oxidation、肽质量容差选0.12 Da、质量测定值选择monoisotopic，然后进行数据库检索。
（8）统计学及生物信息学分析。使用STRING蛋白互作分析、GO分析和KEGG通路注释对各组间差异表达蛋白进行分析处理，GO对蛋白质组学层面的注释来源于DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp），KEGG通路数据库来源于KEGG在线数据库，利用在线服务工具KAAS对提交的蛋白进行注释。GO和KEGG富集分析采用fisher’s exact test进行检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
3.实验结果
（1）红景天苷处理组与模型组的双向电泳图谱分析。在相同条件下，分别对红景天苷处理组和模型组红细胞膜总蛋白各进行3次双向电泳分离，用高灵敏度的快速硝酸银染色后获得分辨率高、重复性较好的电泳图谱各3张。两组样本的蛋白组图谱总体相似，但在碱性端高分子量及酸性端低分子量区域差异较为明显（见图7-9）。使用 PDQuest 8.0 软件并结合人工校正对凝胶图谱进行检测和分析，获得模型组和红景天苷处理组3块凝胶的平均蛋白质点数分别为461±14和438±18，平均匹配的点数分别为382±11和361±15，匹配率分别为82.86%和82.42%，找出差异明显的蛋白质点（差异大于2倍以上且在3组凝胶中均有相同差异）18个，其中在红景天苷处理组表达下调的蛋白点13个，在模型组中表达上调的蛋白点5个。
（2）差异蛋白质点的生物质谱鉴定（见表7-16）。参考红细胞膜蛋白质组学相关文献选取其中差异较为明显的12个蛋白点进行质谱分析，通过NCBI数据库检索，成功鉴定了其中8个蛋白质。
图7-9 模型组和红景天苷处理组红细胞膜的双向电泳图谱
注：箭头指示的蛋白为鉴定成功的差异蛋白质点。
红景天苷给药组共有6个蛋白，即热休克蛋白27、泛素羧基末端水解酶L1、过氧化物还原酶6、热休克蛋白70A1、过氧化物还原酶1和过氧化物还原酶5表达下调，其与能量代谢、氧化应激和细胞凋亡相关。此外，还发现2个蛋白，即UDP-葡萄糖4-差向异构酶和膜联蛋白A1的表达上调，其与细胞增殖分化相关。
表7-16 差异蛋白质点的生物质谱鉴定结果
（3） 生物信息学分析。为了进一步探寻上述差异性蛋白的功能及红景天苷的潜在作用靶点或通路，我们借助生物信息学手段通过STRING 10.5在线分析了上述蛋白的相互作用网络（见图7-10）。研究发现热休克蛋白和过氧化物还原酶是蛋白互作网络的结点蛋白，提示红景天苷可能通过调控热休克蛋白和过氧化物还原酶的活性发挥对慢性高原病的改善作用。接着，通过DAVID分析工具中的GO注释对差异性蛋白进行细致分析（见图7-11的A～C），条目选取包含生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）和细胞组分（cellular component）。结果表明鉴定的差异性蛋白大多为分泌蛋白，这些蛋白参与了氧化应激、氧化还原、过氧化物酶体途径等生物过程。同时，通过KEGG分析亦发现主要与过氧化物酶体途径和MAPK信号通路有关（见图7-11的D）。
图7-10 STRING蛋白相互作用图
图7-11 差异蛋白GO注释和KEGG分析
A：生物过程（biological process）；B：分子功能（molecular function）；C：细胞组分（cellular component）；D：KEGG通路分析
4.讨论
红景天长期用于治疗高原病，其主要活性成分之一的红景天苷，具有抗抑郁、抗焦虑、抗应激、抗疲劳、抗氧化、抗缺氧、抗衰老、改善人体造血功能、改善记忆和预防高原反应等多种药理活性。红景天苷还具有独特的双向调控作用和适应原性作用，能增强机体应对不同刺激的能力，使异常变化指标向正常转变。但红景天苷改善慢性高原病症状的分子机制尚不清楚，基于我们前期研究的药理作用，发现红景天苷可以降低慢性高原病大鼠的红细胞数量，调控红细胞膜脂质成分，改善红细胞膜的功能和细胞代谢活动，进而缓解慢性高原病的相关症状。本研究旨在观察红景天苷对慢性高原病大鼠红细胞膜的蛋白质组学影响，并探讨红景天苷改善慢性高原病的作用机制。
蛋白质组学研究技术借助高分辨率的双向凝胶电泳和质谱鉴定方法从全局角度在蛋白表达水平上研究蛋白表达水平的变化、翻译后修饰及蛋白质相互作用网络，为阐明生物体的生命活动规律提供了强有力的分析手段。蛋白质组学作为研究某一特定时期内细胞内全蛋白质组成和动态变化的一门新兴学科，在医学生物学研究领域，尤其是药物作用靶点和机制研究方面具有良好的应用前景。本研究中，我们通过前期优化双向电泳实验条件，建立了稳定的大鼠红细胞膜总蛋白分离技术平台，并获得稳定的组内和组间重复率。应用PDQuest 8.0软件进行二维凝胶电泳图谱分析时，蛋白点检测和匹配分析须结合人工校正的方法以去除一些较低表达和重复性较差的蛋白点，尽量减小实验误差。蛋白质组学研究使用高分辨率的双向凝胶电泳图谱和后续的PDQuest软件分析方法从全局角度在蛋白质表达水平上研究其变化及蛋白质相互作用，为阐明生物体的生命活动规律提供了强有力的分析工具。通过PDQuest 8.0.1软件进行2-DE图像分析时，蛋白点检测和匹配分析须结合人工校正的方法以去除一些较低表达和重复性较差的蛋白点，尽量减小误差；接着通过质谱鉴定分析对显著变化的差异蛋白点进行鉴定分析，并成功鉴定了8个差异蛋白质点，其主要与能量代谢、氧化应激、增殖分化和细胞凋亡相关；最后通过生物信息学分析发现过氧化物酶体途径在其中扮演着非常重要的角色，但是红景天苷改善慢性高原病的确切作用机制，我们计划通过蛋白免疫印迹和RT-PCR确认。
过氧化物酶体是整体细胞脂质和活性氧物质代谢的关键调节剂，在机体中发挥着很重要的抗氧化作用。鉴定结果中的3个蛋白质，过氧化物酶1、过氧化物酶5和过氧化物酶6，均属于过氧化物酶体家族，是一种普遍存在的半胱氨酸依赖性过氧化物酶家族，在调节细胞内过氧化物水平方面发挥着重要作用。这些酶通常以高水平存在并且能够快速清除过氧化物，它们的寡聚状态显示出明显的变异，并且易于通过过氧化失活和其他翻译后修饰来进行调节。此外，热休克蛋白27和热休克蛋白70均属于热休克蛋白家族，而机体对抗氧化损伤的第一步是识别细胞内环境的氧化性改变。热休克蛋白是一组可溶的细胞内蛋白质家族，占总蛋白量的5%～10%，在应激条件下（如过高热、氧化损伤、物理性或化学性刺激），热休克蛋白表达增加亦与调节细胞内氧化应激有关。
综上所述，红景天苷可使慢性高原病大鼠红细胞膜蛋白表达发生较为明显的改变，借助蛋白质组学鉴定了其中8个差异蛋白，且发现这些差异性蛋白参与氧化应激、氧化还原、过氧化物酶体途径等生物过程。上述研究提示红景天苷可通过红细胞膜蛋白表达并调节红细胞内氧化应激或发挥抗氧化作用，进而改善慢性高原病的症状。
（七）小结
研究显示红景天苷治疗慢性高原病作用机制：红景天苷能够增加耳郭微循环的血流量，扩张微动脉、微静脉管径，加快血流速度；红景天苷具有降低全血黏度、血浆黏度的作用，具有显著升高NO、NOS，降低VEGF、ET-1的作用。通过调节红细胞膜脂质流动性去改善血液循环，进而达到促进供氧和缓解氧化疲劳的功效；通过降低慢性高原病大鼠红细胞膜总胆固醇含量，提高总磷脂含量，改善红细胞的变形能力，提高细胞膜的稳定性；红景天苷可提高慢性高原病大鼠红细胞膜磷脂酸（PA）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）的含量，能改善红细胞膜异常结构和性能，对维持细胞膜稳态有重要作用；红景天苷可调控慢性高原病大鼠红细胞膜Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性消减的程度，改善红细胞膜的功能和细胞代谢活动；通过显著降低慢性高原病大鼠红细胞内Na+和Ca2+浓度，维持细胞内外渗透压平衡，保护红细胞正常形态和功能，提高红细胞膜的稳定性和流动性。红景天苷可调控慢性高原病大鼠EPO的过度表达，改善骨髓象红细胞系的过度代偿性增生。
应用双向电泳法建立了慢性高原病分辨率较高且重复性较好的大鼠红细胞膜蛋白表达图谱。红景天苷干预红细胞膜2-DE图谱中18个蛋白点发生明显变化，其中13个表达上调，5个表达下调；红景天苷可使慢性高原病大鼠红细胞膜蛋白表达发生较为明显的改变，并借助质谱分析成功鉴定了其中8个差异性蛋白。进一步生物信息学分析发现这些差异性蛋白参与了氧化应激、氧化还原、过氧化物酶体途径等生物过程，且主要与过氧化物酶体途径和MAPK信号通路有关。