DUOX及其成熟因子基因的克隆

1996年，Virion等从猪甲状腺组织纯化到了一个具有NADPH氧化酶活性的黄素蛋白[93]，随后他们从人的甲状腺克隆到一个cDNA，编码的蛋白含有1 210个氨基酸残基，其猪的同源物含有1 207个氨基酸残基，两者的分子量约为138 000，称为p138TOX[94]。最后根据甲状腺细胞和中性粒细胞的NADPH氧化酶系统是同源性的，从人的甲状腺组织克隆了两个氧化酶基因，分别称为THOX1和THOX2，两者的同源性达83%[95]。序列分析显示p138TOX与TUOX2为同一个基因，只是前者氨基端缺失了338个氨基酸残基。由于THOX并不仅仅表达于甲状腺组织，其他组织也有表达，因此称为甲状腺氧化酶（THOX）并不恰当，而应当称为双功能氧化酶（DUOX）。DUOX1和DUOX2都是NADPH氧化酶家族的成员。

DUOX1和DUOX2都位于染色体15q15.3，全长75kb。DUOX1和DUOX2的转录方向相反并且被一个约16kb的区域分隔开。DUOX1长度为36kb，含有35个外显子，前两个外显子是非编码的；DUOX2长度22kb，含有34个外显子，第一个外显子是非编码的。人DUOX1含有一个1 551个氨基酸残基组成的开放阅读框，人DUOX2含有1 548个氨基酸残基组成的开放阅读框。

2006年以前，DUOX分子研究的主要障碍是没有合适的异源细胞系统来表达有活性的DUOX。在转染DUOX1或DUOX2的细胞系研究中发现，DUOX会完全滞留在内质网内而且不会产生H2O2[96]。(https://www.daowen.com)

转染DUOX2的HEK293细胞会在钙离子的作用下产生少量的超氧阴离子。这些观察结果使人们认识到了双重氧化酶成熟因子DUOXA1和DUOXA2。这两个基因位于染色体15（图7-7），在DUOX1/DUOX2的基因间区以尾对尾的方式排列，DUOXA1面向DUOX1，DUOXA2面向DUOX2。人DUOXA2含有6个外显子，编码含320个氨基酸残基的5次跨膜片段，在第2个和第3个跨膜区域之间形成了一个巨大的细胞外环状结构，环状结构上含有糖基化位点，通过Northern blot检测到其mRNA是一个优先表达在甲状腺上1.3kb的转录产物，只有少量表达在唾液腺[97]。DUOXA1基因含有8个外显子，Northern blot检测到其mRNA是主要表达于甲状腺上的两个转录产物，分别为约2.9kb和3.5kb，少量表达在食管。

图7-7　A.DUOX2、DUOX1、DUOXA2和DUOXA1的基因的染色体位置示意图。基因的5'和3'非翻译区显示为红色，编码区为蓝色。B.DUOX的二级蛋白质结构示意图。绿色符号表示糖基化位点，DUOX含有7次跨膜片段，氨基端位于胞外，羧基端位于胞内；在DUOX第一个跨膜片段之后有一个巨大的细胞内区域，含有两个可以与Ca2+结合的EF手基序；DUOX蛋白在胞内还含有FAD和NADPH结合位点。细胞外氨基末端含有过氧化物酶结构域，其功能有待于进一步验证