甲状腺细针穿刺标本的分子诊断
FNA的Bethesda报告系统中Ⅲ～Ⅴ类均为不能明确诊断的细胞学类别，对于这类甲状腺结节，临床医生和患者只能选择进行手术后组织病理学检查来明确诊断，却可能导致本为良性结节进行了没有必要的手术，恶性结节接受了不够彻底的手术。因此，针对这类患者补充诊断策略尤为必要。研究者们正积极探寻一些在恶性病变中出现的基因改变或表达水平变化的特异性分子标志物，以期帮助诊断疾病、判断预后、评估治疗可能出现的效果及治疗方案的利弊以行分层治疗决策[35]。分子标志物应具备如下特质：首先，检测方法具有准确性及可重复性，此外要具备较高的灵敏性、特异性和预测值，从而有助于临床决策的制定，改进临床转归。但是，目前尚无足够的临床证据证明分子标志物纳入到对甲状腺结节患者的常规临床诊疗路径中具有更高的卫生经济学效益。
甲状腺癌的分子标志物较多，其研究主要基于FNA 后或甲状腺局部可获得的DNA、RNA 和蛋白组织，以及外周血。目前基因突变、基因表达谱分析、免疫细胞化学（Immunocytochemistry，ICC）标志物及微小RNA（MicroRNA，miRNA）的研究已取得了一定成果。这些分子标志物主要包括以下几类[3，26]：①基于体细胞DNA 的标志物： 如原癌基因BRAF、RAS突变，原癌基因RET/PTC 转染重排，融合原癌基因PAX8/PPARγ重排等。②基于RNA的标志物： 如基因表达芯片[The Gene Expression Classifier （GEC） System]、人类端粒酶逆转录酶mRNA、促甲状腺激素mRNA、半乳凝素-3 mRNA（galectin-3 mRNA）， 以及microRNA等。③基于蛋白质的标志物： 泛素缀和酶（UBE2C）、高活迁移率族蛋白A2（HMGA2）[如半乳凝素-3（Gal-3）、细胞角蛋白-19 （CK19）、肿瘤胚胎蛋白（IMP3）]等。④表观遗传学标志物：如畸变基因超甲基化标志物。⑤外周血中的分子标志物：如TSHR mRNA、异常的DNA甲基化等。
几种已知的基因突变在分化型甲状腺癌中具有高度特异性，其中组织蛋白酶及鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF）基因突变在 PTC中最常见，发生率为35%～ 69%，在其他分化型甲状腺癌中极少见。至今发现的BRAF基因突变类型有40多种，其中第15 外显子上第1799 位核苷酸T→A的错义突变（T1799A），导致翻译蛋白质600 位密码子的缬氨酸（Valine）被替换为谷氨酸（Glutamate），成为活化蛋白质激酶（BRAFV600E），进而使丝裂原活化蛋白激酶（ Mitogen-Activated Protein Kinases，MAPK）下游传导通路异常激活，引起细胞过度增殖、分化，最终导致甲状腺细胞的恶性转化。BRAF V600E突变是甲状腺癌中最常见的基因突变，平均存在于45%的甲状腺乳头状癌和25%甲状腺未分化癌。Xing等[36]报道，存在BRAF 突变的甲状腺肿瘤表现出甲状腺外浸润、淋巴结转移和肿瘤分期更高等恶性程度更高的征象。一项荟萃分析显示581例BRAF突变阳性结节中580例为PTC，假阳性率仅为0.2%，诊断PTC 的特异性将近100%[37]。而另一项对32个研究的荟萃分析显示，在6 372例PTC患者中，有3 244 例患者存在BRAF 基因突变，提示该突变诊断甲状腺癌的敏感性只有约50%，并不高[39]。因此，BRAF基因突变的低敏感性限制了其在甲状腺结节评估中的诊断价值。
RAS 突变是仅次于BRAF 突变后的次常见突变基因，在FTC 占40% ～ 50%，滤泡性乳头状甲状腺癌（Follicular Variant of Papillary Thyroidcarcinoma，FVPTC）中约为10% （滤泡性变异型），滤泡性腺瘤（Follicular Thyroid Adenoma，FTA）中占20% ～40% [38]，而在典型的PTC中较少见，同时RAS突变也存在于良性滤泡性肿瘤中。RAS 突变在甲状腺癌FNA标本中的阳性预测值为74%～87%。检测到RAS 突变则提示恶性肿瘤的可能性为87%～100%。RAS阳性的甲状腺癌为FTC 和FVPTC，提示其在FTC和FVPTC 患者FNA 样本中具有很高的诊断价值。对于RAS 突变阳性的甲状腺结节患者，病变为恶性的可能性较大。RET基因编码酪氨酸激酶（TK）膜结合受体，于滤泡旁细胞高表达，在滤泡状细胞不表达[39]。染色体RET/PTC重排可激活RET基因，引起MAPK下游通路的持续激活，并增强信号转导[39]。这种重排在儿童PTC 和因辐射所致PTC中较多见，但也存在于良性甲状腺结节、甲状腺炎以及家族性或散发的MTC 中。RET基因在PTC的FNA标本中突变率为5%～ 35%，敏感性较低，不适于单独筛查甲状腺癌[3]。PAX8 /PPARγ融合蛋白在FTC中出现的概率为23%～63%，它会引起细胞的过度增殖和分化，但它在甲状腺良性结节中的表达率为2%～13%[40]，因此不能单独应用于甲状腺良、恶性结节的鉴别。总的来说，与BRAF突变相比，这些标志物特异性较低，这些基因标志物的联合使用会显著提高不确定细胞类型的甲状腺结节的诊断敏感性。
研究显示40%～70%的甲状腺癌至少带有一种或几种已知的基因突变，而良性结节几乎检测不到突变。因此DNA突变检测具有很好的阳性预测值，检测阳性患者可直接行全甲状腺切除而省去先腺叶切除后补救切除的步骤。但基因突变检测的敏感性偏低，并非所有恶性肿瘤都能检测到突变，通过DNA检测只能识别不到33%的癌症患者。基因芯片联合检测已知的突变能提高恶性结节的检出率。体细胞突变芯片（SMP）包括BRAF的点突变和RAS亚型H、N、K的检测及RET/PTC1和RET/PTC3、PAX8/PPARY易位检测。在479个病理诊断确定的患者提供的513份FNAB样品中，AUS/PLUS、FN/SFN以及疑似恶性型这3种FNA报告中恶性甲状腺结节的诊断敏感性分别为88%、87%和95%，假阴性率分别为6%、14%和28%。由此可得SMP对诊断FNA不确定型甲状腺结节敏感性有所提高。最近，甲状腺癌中又发现新的基因标志物，如RASAL1突变、TERT 启动子突变，这些可能会增加诊断的敏感性和特异性。
FNAB标本提取RNA，进行基因表达检测可以提高甲状腺癌诊断的敏感性，尤其对FNAB结果为“不确定”的结节，基因表达芯片（GEC）检测对甲状腺癌的诊断具有重要阴性预测价值。芯片上整合的基因包括多种与细胞发生、细胞黏附、细胞外基质等相关的通路分子。Alexander EK等的前瞻多中心研究发现[8]，以含167个基因表达分类芯片检测FNA结果为AUS的样本，诊断敏感性92%、阴性预测值为93%，提示：如果芯片mRNA表达阴性，则恶性的可能性极低，因其特异性平均48%～53%，不能明确诊断恶性病变。因为GEC的低阳性预测值，所以并不适用于可疑恶性肿瘤鉴别。美国一项成本效益分析显示，对FNAB结果“不确定”的结节，行基因表达分析（FNA+GEC），结果FNA+GEC组比单纯FNA方法进行诊治的成本效用更佳，使74%的患者免于手术，改善了患者生活质量。
免疫细胞化学（ Immunocytochemistry，ICC ）已广泛应用于临床研究，但是，由于观察者之间对于ICC涂片的解释及分级不同，很难标准化，使得ICC未能广泛应用于临床实践。尽管各研究中标志物的敏感性及特异性变化较大，但联合检测一些ICC 相关标志物可能有助于区分甲状腺结节的良、恶性[41]。半乳糖凝集素3（ Galectin-3）是甲状腺肿瘤中研究最多的分子标志物之一[42]，是长度为30kDa糖结合蛋白，在正常组织与肿瘤组织中均有表达，参与细胞周期调控、细胞生长与凋亡，也参与肿瘤细胞转化、迁移、侵袭和转移等过程。研究表明，在滤泡型癌组织和乳头状癌组织中Galectin-3 高表达，而在腺瘤和多结节性甲状腺肿组织中的表达却相对较低[43]。在近期的研究中Galectin-3 在不确定型甲状腺结节的诊断中显示出了较好的诊断价值。在432例手术病理证实为恶性甲状腺疾病中，Galectin-3敏感性度78%、特异度为93%。预估的阳性预测率为82%，阴性预测率为91%。手术前诊断准确率为88%。尽管Galectin-3的诊断率略低于GEC系统和以上讨论的基因标志物，Galectin-3试验更易于操作、成本低且不需要复杂的仪器。细胞角蛋白19 （ cytokeratin-19，CK-19 ） 是一种由上皮细胞分泌的相对分子质量较低的角蛋白，可用于PTC与FTC 和滤泡性腺瘤等的鉴别。两种蛋白联合检测能提高灵敏性和特异性，如，当CK-19与Galectin-3 联合，或间皮细胞表面微绒毛抗原1与Galectin-3 进行联合检测，可大大提高诊断甲状腺嗜酸细胞瘤的灵敏性和特异性。
miRNA 是一类短序列、非编码的RNA，通过与其靶基因的特异信使RNA 结合来调控基因表达。有文献报道[41]，一组包含7 个miRNAs 的分子标志物被用于甲状腺FNA样本的诊断，当出现3个或更多的这些miRNAs 包括mir-222、mir-221、mir-146b、mir-224、mir-155、mir-187 和mir-155 表达上调时，则预示该结节为恶性，FNA的诊断正确率为98%。该结果表明，miRNAs 可以应用于临床诊断，并且有助于提高术前甲状腺FNA的诊断准确率。然而，这些指标在临床实践中的应用还有待进一步研究。
近年来，在甲状腺结节和甲状腺癌的诊断分子标志物的鉴定和开发已经取得了巨大进展。包括GEC、BRAF突变的基因组、RAS突变、RET-PTC和PAX8-PPARγ，以及蛋白标志物Galectin-3在内的生物标志物，越来越多地应用于甲状腺结节FNA的辅助性诊断学分子检查。最好的研究预后的标志物是BRAFV600E突变，有助于当前的PTC风险分级。最近发现的TERT启动子突变可增强其作用。RAS突变因其在FTC和PDTC中具有潜在的预后价值，值得进一步研究。几种其他分子标记，如基于外周血的分子标志物，作为甲状腺癌的诊断和预后的分子标志物具有巨大的潜力，值得进一步的探索。随着更多的分子标志物被发现，当前的标志物被更好地应用于适当的临床用途。
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