3.2.3 植物离体无性繁殖方法和影响因素
1）植物离体无性繁殖方法
（1）母株制备
母株是指用于发生离体培养无性系的植物材料。母株制备即无菌培养物建立阶段，是进行离体无性繁殖的基础和前提。技术要点：一是材料灭菌。应选择干净、健康、无病虫害的材料，根据不同的外植体材料特点，如幼嫩程度、有毛或无毛、生长在地上或地下、芽有无鳞片包裹等，以及不同灭菌剂的灭菌效果，采用适当的灭菌方式，以取得最理想的灭菌效果。二是培养基筛选。根据植物种类和品种、外植体类型及培养目的选择适宜的基本培养基。同时，重点考虑培养基中附加成分如糖量及植物激素种类和浓度的筛选。
（2）增殖
增殖即繁殖体的增殖阶段，使无菌母株在无菌条件下通过各种离体繁殖途径扩增，这一时期是快速繁殖过程中最主要的阶段。选择适宜的激素种类及浓度配比，将培养基渗透压及酸碱度适当调整都极其重要。在外植体增殖过程中，应注意适当调整继代培养时激素的浓度以减弱外源激素的积累对芽增殖质量的影响，防止发生形态变异。
（3）植株再生
再生是指将继代增殖的小芽或苗，转移至生根培养基中，诱导根分化，最终形成具根、茎、叶的完整小植株的过程。诱导小芽或苗根的分化技术关键也在培养基，多数植物根分化需高水平生长素，低水平细胞分裂素或仅有生长素即可，见表3.1。有些植物生根甚至无需任何植物激素。一些难生根的植物用生长素加黑暗处理效果好。此外，部分研究发现，培养基中无机成分下降、糖含量减少一半对生根也有帮助。诱导小芽或苗生根也可在无土基质上进行。如糠灰、泥炭、蛭石、珍珠岩、沙等基质灭菌后使用或直接扦插。如西瓜、苹果，试管苗诱导生根频率虽然很高，但小植株移栽成活率较低，可采用嫁接生根法解决，即将无根小苗直接嫁接在根系良好的砧木上。
（4）壮苗、炼苗和移栽
试管苗长期处于无菌和异养条件下，生长势较弱，对外界环境的适应能力差，在移栽之前必须先要培育壮苗并开瓶炼苗。壮苗是移栽成活的首要条件，方法因材料和情况不同而异。在很多植物中往培养基中加入一定数量的生长延缓剂如多效唑、比久或矮壮素等都是培育壮苗的有效措施。经壮苗后，炼苗驯化过程要逐步过渡，首先在培养室提前一周左右打开瓶盖，使小苗从无菌状态转为自然状态，并逐步适应周围环境的湿度。再通过一定强度日光锻炼，使小苗从异养状态过渡到自养状态。移栽时将小苗基部培养基冲洗干净栽入经灭菌的基质中，保持空气湿度为70%～90%，待小苗适应后，可转入温室或田间正常生长。
表3.1 不同基质对苹果离体生根的影响(https://www.daowen.com)
2）植物离体无性繁殖的影响因素
外植体经诱导、增殖、分化过程产生完整植株，是一个复杂的演变过程，受多种因素影响，如培养基、培养条件、外植体等。
（1）培养基
对大多数作物来说，MS培养基均可作为基本培养基，此外，LS、SH等培养基也比较适合。通常，培养基的细胞分裂素浓度范围为1～2 mg／L，首选经济实效的6-BA。生长素使用浓度范围为0.1～1 mg／L，IAA因不稳定而更多使用NAA、IBA。诱导愈伤组织或体细胞胚胎发生选用2，4-D，促茎芽繁殖等其他途径应尽量避免使用2，4-D。而生根培养中，大多植物适于低盐培养基，即1／2 MS、1／2 LS，常用生长素IAA、IBA、NAA或无激素培养基促根发生、发育。
（2）培养条件
离体无性繁殖与温度、光照、湿度等密切相关。一般多数植物控制在25℃±2℃，一般不低于15℃，不高于35℃。促进芽形成的温度略低，如烟草芽形成在18℃最佳。而光周期保持每天16 h光照，8 h黑暗，一般可以得到令人满意的诱导效果。光强常为1 000～5 000 lx，而有些植物器官形成则不需要光。湿度一般要求环境湿度保持为70%～90%，否则易使培养基失水变干或长霉污染。
（3）外植体
不同的材料来源、组织或器官类型、外植体大小、生理年龄等诱导率有很大差异。茎尖、茎段、根、叶、花、子叶、花皆可作为离体无性繁殖的外植体，如何确定取材部位既要考虑外植体材料来源丰富，容易成苗，又要考虑外植体本身在培养中的遗传稳定性，使试管苗整齐一致。
