4.4.1 原生质体融合
原生质体融合即细胞融合，也称为体细胞杂交。是将分离出来的不同亲本的原生质体通过一定的诱导技术使质膜接触，从而发生膜融合、胞质融合、核核融合形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。为了与有性杂交区分开，原生质体融合常写作：“a（+）b”其中a和b是2个融合的亲本，（+）表示体细胞杂交。
1）原生质体融合方法
（1）化学融合
化学融合指利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。自Carlson等1972年获得第一株烟草体细胞杂种植株以来，原生质体融合时使用过的化学融合剂有NaNO3、溶菌酶、明胶、高pH-高浓度钙离子、PEG、抗体、植物凝血素伴刀豆球蛋白A及聚乙烯醇等。
①NaNO3融合法：NaNO3能诱导原生质融合的原因是钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体的质膜紧密接触，促进细胞融合。优点是盐类融合剂对原生质体的活力破坏力小，缺点是诱导融合频率低，仅为0.1%～4%，因此该方法现在已很少应用。
②高pH-高浓度钙离子融合法：高pH高Ca2+法是受动物细胞融合研究启发而产生的。以烟草为例，融合方法如下：
a.2个亲本原生质体按1∶1比例混合，使终浓度为2.5×105个细胞／mL。
b.在50 g下离心3～5 min，使原生质体沉积在一起。
c.去上清液，加入2mL融合液（融合液含有50mmol／L CaCl2。H2O+400mmol／L甘露醇，用甘氨酸-NaOH缓冲液调整pH为10.5。
d.50 g下离心3～5 min，使原生质体沉积。
e.离心管置于37℃水浴30 min。
f.用清洗介质置换融合液，放置30 min。
g.用清洗介质洗2次，将原生质体悬浮在培养基中培养。该方法优点是杂种产量高，缺点是高pH值对细胞有毒害作用。
③聚乙二醇（PEG）融合法：PEG分子具有轻微负极性，可与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键。当PEG分子链足够长时，它在相邻原生质体表面之间起分子桥作用，引发原生质体粘连。与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配。当两层膜紧密接触区域的电荷重新分配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连到另一种原生质体的带负电荷的基团上，导致原生质体融合。另外，PEG能增加类脂膜的流动性，能够对细胞的融合具有促进作用。以马铃薯为例，融合方法如下：
a.用原生质体培养基调整双亲原生质体密度为1×106个／mL，按1∶1比例混合。
b.将2 mL原生质体混合液移入规格为6 cm的培养皿中，用滴管缓慢滴加2 mL混合液，混合液组成为30%PEG+10mmol／L CaCl2·2H2O+0.7mmol／L KH2 PO4+0.1 mol／L葡萄糖，用1 mol／L HCl和KOH调整pH为5.6，边加边轻微摇动，使原生质体悬浮液充分混合，然后静置培养15 min。(https://www.daowen.com)
c.缓慢加入2 mL 0.08 mol／L CaCl2溶液，培养10 min。
d.加入5 mL原生质体培养基，在750 r／min下离心5 min，去上清液，将沉淀物用原生质体培养基重复洗涤2次后进行培养。大豆-豌豆融合细胞融合率最多可达50%。
该方法优点是融合频率高，可重复性强，诱发融合无特异性。缺点是融合过程比较烦琐。
（2）电融合
电融合是指利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生可逆性电击穿，促使原生质体融合的方法。以马铃薯为例，电融合方法如下：
a.将两个亲本的原生质体分别以1×106个／mL的密度悬浮于与原生质体等渗的甘露醇（0.55 mol／L）融合液中，按1∶1比例混合。
b.用滴管将悬浮液加入融合室电极内。
c.选定正弦波频率，逐步加大其峰—峰电压。显微镜下观察，当形成2～3个原生质体细胞串时，施加瞬时高压直流电脉冲。所用电压大小及脉冲宽度的标准是能使细胞串轻微振动而又不使其断裂为度。
d.融合完毕后，在500 r／min下离心5 min，去融合液后进行培养。电融合方法具有效率高、对原生质体伤害较小、对融合细胞数易于控制等优点。
2）原生质体融合过程
经过化学法、PEG法等进行融合的细胞，其原生质体融合的基本过程包括4个阶段：
a.凝聚作用阶段。期间2个或2个以上的原生质体的质膜，在诱导剂或正弦电场作用下相互靠近。
b.2个相邻原生质体之间在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合。在2个原生质体间呈连续状态。
c.由于细胞质桥的扩展，融合完成，形成球形的异核体或同核体。
d.两个亲本原生质体质膜上的受体、糖蛋白、糖脂等成分也在融合后的质膜上重新分布，开始形成细胞壁，完成融合，形成单核融合细胞。
