黄鼬干粉胶囊对再生障碍性贫血模型小鼠造血功能的影响
摘要
【目的】观察黄鼬干粉胶囊对再生障碍性贫血（AA）模型小鼠造血功能的影响及作用机制。【方法】采用X射线+环磷酰胺+氯霉素复合方法复制小鼠AA模型，观察黄鼬干粉胶囊对小鼠外周血象、骨髓有核细胞数（BMNC）、骨髓粒细胞-巨噬细胞集落生成单位（CFU-GM）、血清中可溶性细胞间黏附因子1（sICAM-1）和骨髓组织病理学的影响。【结果】黄鼬干粉胶囊能明显增加模型小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT数量，能增加骨髓BMNC数量，还能升高骨髓CFU-GM和降低血清sICAM-1。与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。骨髓组织病理学结果表明，黄鼬干粉能明显改善模型小鼠骨髓增生低下和造血灶减少，促进骨髓造血。【结论】黄鼬干粉胶囊能改善AA模型小鼠造血功能，其作用机制可能与调节骨髓CFU-GM和血清sICAM-1的平衡有关。
黄鼬（学名Mustelasibirica），俗名黄鼠狼，为鼬科小型杂食动物［1］。黄鼬肉骨在中国民间历来被视为一种药材，认为具有抗癌、增强免疫力等功效，对急性白血病（AL）、再生障碍性贫血（AA）、免疫性血小板减少症等疾病也有一定疗效。甘肃陇东地区民间常以黄鼬干粉用于AA及AL化疗后骨髓抑制患者，也用以治疗骨髓增生低下性疾病，效果满意。本实验拟观察黄鼬干粉胶囊对AA模型小鼠骨髓造血功能的影响。
1.材料与方法
1.1实验动物
昆明小鼠，SPF级，雌雄各半，体质量18～22g，由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物场提供，实验生产许可证号：SCXK（甘）2010-0001，动物实验合格证号：0000981。
1.2药物和试剂
黄鼬干粉胶囊（甘肃省庆阳市中医医院提供，批号：130706），临用前将药粉用8倍量蒸馏水浸泡2h，水浴锅煎煮30min，800rpm离心5min，取上清液，80℃浓缩至30%和90%的浓度，4℃冰箱保存备用；司坦唑醇片（广西南宁百会药业集团有限公司生产，批号：130416）；注射用环磷酰胺（CTX）（山西普德药业股份有限公司生产，批号：04120103）；氯霉素注射液（山东鲁抗辰欣药业有限公司生产，批号：130523）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司生产，国药准字H13020657）；注射用硫酸链霉素（华北制药股份有限公司生产，批号：20130615）；M199培养基（上海源叶生物科技有限公司生产，批号：130811）；马血清（郑州益康生物有限公司生产，批号：130608）；琼脂粉（青岛高科园海博生物技术有限公司生产，批号：20130406）；ELISA（sICAM-1）试剂盒（产品型号E12789，规格96T，上海华壹生物有限公司生产，批号：20130522）。
1.3实验仪器
医用直线加速器（型号BD-6M，北京医疗器械研究所提供）；低温高速离心机［Biofugefresco（美国）］；血细胞分析仪［CD1200（美国）提供］；奥林帕斯生物显微镜［Olympus公司（日本）生产］；BS110S型sartorius电子天平（北京赛多利斯天平有限公司提供）。
1.4实验方法
1.4.1对AA模型小鼠外周血象、骨髓有核细胞数（BMNC）和骨髓组织病理学的影响［2-4］
1.4.1.1分组、造模、给药
取小鼠50只，随机分为5组，每组10只。除正常对照组外，其余各组采用医用直线加速器X射线一次性全身照射（皮源距100cm，辐射剂量为8.0Gy/min，辐射时间为4min），分别于第4天、5天、6天腹腔注射环磷酰胺50.0mg/kg及氯霉素62.5mg/kg，连续3d。造模的同时，正常对照组和模型对照组灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃司坦唑醇片1mg/kg（相当于人体临床日用量的10倍），黄鼬干粉胶囊高、低剂量组分别灌胃黄鼬干粉胶囊煎液18g/kg和6g/kg（相当于临床人1日用量的30倍和10倍）。均为0.02mL/g，各组每天1次，连续15d。
1.4.1.2外周血象及BMNC计数
末次给药后次日，摘眼球取血，用血细胞分析仪测定外周血象变化。随后各组小鼠脱颈椎处死，分离出两侧股骨。取右侧股骨中段7mm，用3%冰醋酸溶液10mL冲出全部骨髓，并经6号针头抽吸一次，分散骨髓细胞。然后通过血细胞计数板在显微镜下计数骨髓有核细胞数（BMNC）。
1.4.1.3骨髓切片制备与观察
将左侧股骨浸入4%中性甲醛内固定2h，再用2%的硝酸脱钙2h，水洗2次，室温下乙醇梯度脱水各2次，然后用甲液、乙液顺序浸透各12h，用包埋液封闭，放入-20℃冰箱内过夜，第2天进行切片，苏木素-姬姆萨-伊红染色，最后置于光学显微镜下观察骨髓增生程度及造血细胞变化。
1.4.2对AA模型小鼠粒-巨噬细胞集落生成单位（CFU-GM）、可溶性黏附因子1（sICAM-1）的影响［5-8］
1.4.2.1小鼠骨髓CFU-GM的检测
小鼠分组、模型制备及给药同上。培养体系为含20%马血清的M199培养液3.5mL，5块0.3mm3小鼠肺组织生成的细胞刺激因子，适量青、链霉素（浓度100U/mL、100μg/mL），分别加入以上各组，各时间点小鼠的骨髓单个核细胞（终浓度为2×105），置于37℃水浴15min，加入琼脂0.3mL（终浓度为0.3%），再放入2.7%的甲基纤维素（终浓度为0.9%），振荡混匀后浇入培养皿，移入含5%CO2培养箱，37℃培养7d，用倒置显微镜计数各组生成的细胞集落，≥50个细胞组成的细胞团为1个细胞集落。
1.4.2.2小鼠血清sICAM-1的检测
末次给药后，小鼠眼眶静脉窦取血0.5mL，室温放置20min，以3000r/min离心20min，取血清5μL，按试剂盒说明书操作，检测血清中sICAM-1浓度值。
1.5统计学方法
所有数据均经SPSS15.0统计学软件进行处理，计量资料用（
±S）表示，采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.结果
2.1各组小鼠外周血象和BMNC比较
模型对照组小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT数量明显减少，BMNC数明显降低，与正常对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。司坦唑醇片组和黄鼬干粉胶囊高、低剂量组小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT数量以及BMNC数量明显增加，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。(https://www.daowen.com)
正常对照组骨髓增生活跃，全片有核细胞密布，巨核细胞多见。模型对照组骨髓增生极度低下，造血细胞明显减少，大量脂肪细胞代替造血细胞，间质水肿，巨核细胞未见。黄鼬干粉胶囊高、低剂量组及司坦唑醇片组仍显示骨髓增生低下，但可见散在造血灶，偶见巨核细胞。见图1。
表1 各组小鼠外周血象和BMNC比较
注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
图1 各组小鼠骨髓组织病理学表现（40×）
2.2各组小鼠骨髓CFU-GM、血清SICAM-1比较
采用X射线+环磷酰胺+氯霉素复合方法复制小鼠AA模型，模型对照组小鼠骨髓CFU-GM生成量明显降低，血清中SICAM-1明显升高，与正常对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。司坦唑醇片组和黄鼬干粉胶囊高、低剂量组均能提高模型小鼠骨髓CFU-GM生成量，降低小鼠血清中SICAM-1含量，与模型对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。
表2 各组CFU-GM、SICAM-1比较（骨髓细胞数4×105）
注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
3.讨论
AA是一组由化学、物理、生物及自身免疫等因素所致的骨髓造血干细胞和（或）造血微环境损伤而出现的造血功能衰竭性疾病。其主要的病理改变是红骨髓向心性萎缩，被脂肪髓代替，无恶性细胞及网状纤维增生，以致外周血液中全血细胞减少，出现贫血、出血、感染等临床症状［9-10］。AA属于中医“髓劳病”范畴［11］。《本草纲目》记载，黄鼬的肉甘、温，有小毒，入肺、肾二经，具有杀虫疗疮、温肾缩尿的功效，治疥疮、疮溃不愈合、尿频等症。甘肃陇东地区民间AA及AL化疗后骨髓抑制的患者大多服用黄鼬干粉［12-13］，但相关实验研究尚未见报道。本实验研究表明，采用X射线+环磷酰胺+氯霉素复合方法复制小鼠AA模型，黄鼬干粉胶囊能明显增加模型小鼠外周血中HGB、RBC、WBC和PLT数量，能增加骨髓BMNC和CFU-GM数量，降低血清SICAM-1水平。骨髓组织病理学结果表明，黄鼬干粉胶囊能明显改善模型小鼠骨髓增生低下和造血灶减少，促进骨髓造血。其治疗AA的作用机制可能与调节骨髓CFU-GM和血清sICAM-1的平衡有关。本研究为中医临床使用黄鼬干粉胶囊治疗AA和进一步新药研发提供了药理学实验依据。
参考文献
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（刊登于《西部中医药》2016年第29卷第2期，姚金华、夏小军、马骏、杜志荣 等作）