回生胶囊毒理学、药效学实验研究
摘要
【目的】对回生胶囊进行小鼠急性毒性实验，并观察回生胶囊与化疗或放疗合用时对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤增效、减毒作用，以及对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响。【方法】急性毒性实验因未测出小鼠致死剂量，无法测定LD50，故改测最大给药量；药效学实验采用回生胶囊8.1g、2.7g生药每千克（体质量）给荷瘤小鼠灌胃。【结果】小鼠灌胃给药回生胶囊未发现明显毒性反应，1日最大给药量为42g/（kg·d），是临床人日口服剂量0.09g/（kg·d）的467倍；对环磷酰胺（CTX）化疗或X射线放疗抗小鼠S180肉瘤有增效作用；对CTX或放疗减少S180荷瘤小鼠白细胞和红细胞数有抑制作用；能提高小鼠吞噬细胞的吞噬功能，增强机体非特异性免疫功能；促进小鼠特异性抗体的产生和分泌，增强小鼠的特异性体液免疫功能；促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应，增强小鼠的特异性细胞免疫功能。【结论】回生胶囊1日内过大剂量口服是安全的，与化疗或放疗药物联合应用有增效和减毒作用，同时能增强机体的免疫功能。
回生胶囊系庆阳市中医医院血液科专科制剂（庆阳市中医医院院内制剂，批准文号：甘药制字204101013）。其主要功效为清热解毒，活血化瘀，化痰散结。用于治疗急、慢性白血病，骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤及恶性组织细胞肿瘤；肝癌、胃癌、食道癌、肺癌等非造血系统恶性肿瘤；因放、化疗引起的白细胞减少、血小板减少、造血功能障碍、免疫功能低下等。本研究对回生胶囊毒理学、药效学进行实验研究，现报道如下。
1.材料与方法
1.1实验药物
回生胶囊（庆阳市中医医院提供，批号：120613），临用时以蒸馏水配成所需浓度的溶液；贞芪扶正胶囊（甘肃扶正药业科技股份有限公司生产，批号：120421）；注射用环磷酰胺（CTX，山西普德药业股份有限公司生产，批号：04120103）；RPMI1640（Gibco产品）；ConA（Sigma产品）；MTT（Sigma产品）；胎牛血清（兰州生物制品研究所产品）S180；肉瘤瘤株（甘肃省医学科学研究院提供）。
1.2实验动物
昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，体质量18～22g，由兰州大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（甘）2009-0004，医用动物合格证号：0002493。
1.3实验仪器
BD-6M医用直线加速器（北京医疗器械研究所）；低温高速离心机［Biofuge fresco（美国）］；BS110S型sartorius电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；VP-5035Q高压蒸汽消毒锅（长春百奥生物仪器公司）；CD1200血球计数仪（美国雅培）；BPN型CO2培养箱（上海一恒科学仪器公司）；UV-9100型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；连续波长酶标仪［BenchmarkPlus（美国）］。
1.4方法
1.4.1急性毒性实验
1.4.1.1LD50测定［1-3］
取小鼠15只，雌雄各半，随机分为A、B、C3组，每组5只。各组小鼠禁食不禁水12h后分别灌胃给药，A组灌胃35.00%回生胶囊0.04mL/g（体质量）；B组灌胃17.50%回生胶囊0.04mL/g（体质量）；C组灌胃8.75%回生胶囊0.04mL/g（体质量）；各组均给药1次，观察给药后7d内小鼠死亡情况，见表1。
表1 小鼠LD50测定结果
由表1可见，各组小鼠给药后7d内均未出现死亡，按有关文献要求改测最大给药量。
1.4.1.2最大给药量测定
取小鼠60只，雌雄各半，随机分为3组，每组20只。各组小鼠禁食不禁水12h后，按最大给药量0.04mL/g（体质量）灌胃35%（最大可给药浓度）回生胶囊，实验各组分别于1日内给药3次、2次、1次，给药间隔6h。观察记录各组小鼠给药后7d内的反应情况，以不产生死亡的最大剂量为最大给药量，并按下式计算相当于临床1日给药量倍数：
小鼠最大给药量倍数=［（小鼠1日最大给药量）/小鼠平均体质量（20g）］×［成人平均体质量（60000g）/成人每日用量］
1.4.2抗肿瘤增效实验［4-5］
1.4.2.1对化疗抗S180肉瘤的增效作用
在无菌条件下抽取接种S180肉瘤细胞8d的小鼠腹水，按1∶3无菌生理盐水稀释至约含S180肉瘤细胞1×107个/mL。取小鼠50只，雌雄各半，无菌条件下每只小鼠右前肢腋窝皮下注射S180。腹水瘤细胞悬液0.2mL，24h后按性别体质量随机分为5组，每组10只。荷瘤对照组和化疗药CTX组灌胃生理盐水；阳性药+CTX组灌胃贞芪扶正胶囊12.5g生药每千克（相当于临床用量30倍）；回生胶囊大、小剂量+CTX组分别灌胃回生胶囊8.1g生药每千克（相当于临床用量30倍），2.7g生药每千克（相当于临床用量10倍）。均为0.02mL/g，各组每天灌胃1次，连续10d。接种肿瘤后第2天和第6天，除荷瘤对照组外，其余各组腹腔注射CTX30mg/kg。末次给药24h，处死小鼠，剥离瘤块并称重，计算抑瘤率：
抑瘤率（%）=（荷瘤对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/荷瘤对照组平均瘤重×100%
1.4.2.2对放疗抗S180肉瘤的增效作用
分组同“1.4.2.1”项下方法。荷瘤对照组和放疗组灌胃生理盐水；阳性药+放疗组灌胃贞芪扶正胶囊12.5g生药每千克（相当于临床用量30倍）；回生胶囊大、小剂量+放疗组分别灌胃回生胶囊8.1 g生药每千克（相当于临床用量30倍）、2.7g生药每千克（相当于临床用量10倍）。均为0.02mL/g，各组每天灌胃1次，连续10d。接种肿瘤后第5天，除荷瘤对照组外，其余各组小鼠均采用医用直线加速器低能X射线一次性全身照射（皮源距100cm，辐射剂量为200 mGy/min，辐射时间为5min）。末次给药24h，处死小鼠，剥离瘤块并称重，按下式计算抑瘤率：
抑瘤率（%）=（荷瘤对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）×100%
1.4.3抗肿瘤减毒实验［4-5］
1.4.3.1对CTX抗S180肉瘤毒性的减毒作用
分组同“1.4.2.1”项下方法。同时另取小鼠10只，雌雄各半，为正常对照组。正常对照组、荷瘤对照组和化疗药CTX组灌胃生理盐水；阳性药+CTX组灌胃贞芪扶正胶囊12.5g生药每千克（相当于临床用量30倍）；回生胶囊大、小剂量+CTX组分别灌胃回生胶囊8.1g生药每千克（相当于临床用量30倍），2.7g生药每千克（相当于临床用量10倍）。均为0.02mL/g，1次/d，连续10d。接种肿瘤后第2天开始，除正常对照组和荷瘤对照组外，其余各组腹腔注射CTX 20mg/每千克，1次/d，连续10d。末次给药后24h，采血，测定红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血小板（PLT）。
1.4.3.2对放疗抗S180肉瘤毒性的减毒作用
分组同“1.4.2.1”项下方法。同时另取小鼠10只，雌雄各半，为正常对照组。正常对照组、荷瘤对照组和放疗组灌胃生理盐水；阳性药+放疗组灌胃贞芪扶正胶囊12.5g生药每千克（相当于临床用量30倍）；回生胶囊大、小剂量+放疗组分别灌胃回生胶囊8.1g生药每千克（相当于临床用量30倍）、2.7g生药每千克（相当于临床用量10倍）。均为0.02mL/g，1次/d，连续10d。接种肿瘤后第5天，除正常对照组和荷瘤对照组外，其余各组小鼠均采用医用直线加速器X射线一次性全身照射（皮源距100cm，辐射剂量为4.0Gy/min，辐射时间为4min）。末次给药24h，采血，测定RBC，WBC，PLT。
1.4.4对荷瘤小鼠免疫功能的影响［6-8］
1.4.4.1对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
于无菌条件下抽取接种S180肉瘤细胞8d的小鼠腹水，按1∶3无菌生理盐水稀释至约含S180肉瘤细胞1×107个/mL。取小鼠40只，雌雄各半，无菌条件下每只小鼠右前肢腋窝皮下注射S180腹水瘤细胞悬液0.2mL，24h后按性别体质量随即分为4组，每组10只。另取小鼠10只，雌雄各半，为正常对照组。正常对照组和荷瘤对照组灌胃生理盐水；阳性药组灌胃贞芪扶正胶囊12.5g生药每千克（相当于临床用量30倍）；回生胶囊大、小剂量组分别灌胃回生胶囊8.1g生药每千克（相当于临床用量30倍），2.7g生药每千克（相当于临床用量10倍）。均为0.02mL/g，1次/d，连续10d。各组小鼠分别于给药后第2天和第7天，腹腔注射5%可溶性淀粉溶液0.5mL/只。给药第10天，各组小鼠腹腔注射普通肉汤2mL/只，轻揉腹部，10min后处死小鼠，剖开腹腔，吸取腹腔液0.1mL于洁净载物片上，加1%鸡红细胞悬液0.1mL，充分混匀，置于湿盒内37℃水浴30min，用生理盐水漂洗3次，室温自然干燥。将标本进行瑞氏染色，光镜下计数巨噬细胞200个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数：
吞噬百分率（%）=发生吞噬的巨噬细胞数/200个巨噬细胞× 100%
吞噬指数=发生吞噬的巨噬细胞数/200个巨噬细胞
1.4.4.2对小鼠血清溶血素含量的影响（HC50法）
小鼠S180肉瘤接种、分组和给药同“1.4.4.1”项下方法。各组小鼠给药第4天腹腔注射50%绵羊红细胞悬液02mL/只。给药10d后，小鼠股动脉放血，分离血清，560℃，30min灭活补体。将各组小鼠血清用生理盐水稀释600倍，取稀释血清0.5mL与5%绵羊红细胞0.5mL、1mL按1∶10稀释新鲜豚鼠血清（补体）于试管中混合，37℃水浴反应30min，冰浴终止反应。然后1500rpm离心10min。取上清液1mL于另一试管，加入3mL都氏试剂，反应10min。以不加血清而用生理盐水代替，但同样加入绵羊红细胞及补体作为样品空白对照管。同时取5%绵羊红细胞0.25mL，加都氏试剂至4 mL，摇匀放置10min，作为50%标准溶血管。540nm比色，按下式计算血清溶血素滴度：
溶血素滴度（HC50单位/mL）=［样本OD值/50%标准溶血管OD值］×血清稀释倍数
1.4.4.3对小鼠脾脏淋巴细胞转化的影响（MTT染色法）
小鼠S180肉瘤接种、分组和给药同“1.4.4.1”项下方法。给药10d后处死各组小鼠，无菌下摘取脾脏，将小鼠脾脏用含抗生素的无Ca+、Mg+的Hank's液冲洗3次，剥去包膜，置无菌玻璃平皿中，加入2mL完全细胞培养液，用无菌T.B.注射器芯在100目钢网上研磨，用2～3mL RPMI1640液冲洗过滤成单个脾细胞悬液。计活脾细胞数（台盼兰染色法），活细胞应不少于95%。用完全细胞培养液稀释成106个/mL脾细胞悬液。将脾细胞悬液加入96孔细胞培养板，0.1mL/孔，每个样本平行4孔，前两孔每孔加入10μg/mL ConA溶液0.1mL，后两孔每孔加入细胞培养液0.1mL作为平行对照。置5%CO2培养箱37℃培养60h时，每孔加1mg/mL MTT溶液0.1mL，37℃反应6h。弃去上清液，用pH7.4，0.01MPBS洗涤2次，弃去上清液，加酸化异丙醇0.2mL/孔，室温反应10min，在酶标仪640nm处读取OD值，按下式计算淋巴细胞增殖指数：
淋巴细胞增殖指数=加入ConA孔OD值/加入培养液孔OD值
1.5统计学方法
数据采用SPSS13.0统计软件分析，计量资料以（
±S表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准为α=0.05。
2.结果
2.1急性毒性实验
给药后观察7d，3个给药组均未出现死亡，也未发现明显毒性反应。小鼠最大给药量为42g/（kg·d），相当于人临床日用量0.09g/（kg·d）的467倍，见表2。
表2 小鼠最多给药量实验结果(https://www.daowen.com)
2.2对CTX抗S180肉瘤的增效作用
CTX能减轻S180肉瘤小鼠的瘤重，荷瘤对照组与CTX组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。回生胶囊和CTX联合应用，亦能减轻S180肉瘤小鼠的瘤重，与CTX组比较，大、小剂量组均有统计学差异（P＜0.05），说明回生胶囊对CTX抗小鼠S180肉瘤有增效作用，见表3。
表3 回生胶囊对CTX抗小鼠S180肉瘤作用的影响（
±S）
注：与CTX组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
2.3对放疗抗S180肉瘤的增效作用
放疗能减轻S180肉瘤小鼠的瘤重，荷瘤对照组与CTX组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。回生胶囊和放疗联合应用，亦能减轻S180肉瘤小鼠的瘤重，与放疗组比较，大、小剂量组差异有统计学意义（P＜0.05），说明回生胶囊对放疗抗小鼠S180肉瘤有增效作用，见表4。
表4 回生胶囊对放疗抗S180肉瘤作用的影响（
±S）
注：与放疗组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
2.4对CTX抗S180肉瘤毒性的减毒作用
与正常对照组比较，荷瘤对照组小鼠RBC，WBC和PLT无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。CTX可降低荷瘤小鼠的WBC和RBC，荷瘤对照组与CTX组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），但对荷瘤小鼠的PLT无明显影响。回生胶囊和CTX联合应用，可对抗CTX降低荷瘤小鼠WBC和RBC的作用，与CTX组比较，大剂量组差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。
表5 回生胶囊对CTX抗S180肉瘤毒性的影响（
±S）
注：与CTX组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
2.5对放疗抗S180肉瘤毒性的减毒作用
荷瘤对照组小鼠RBC，WBC和PLT无明显变化，与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。放疗可降低荷瘤小鼠的WBC和RBC，荷瘤对照组与放疗组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），但对荷瘤小鼠的PLT无明显影响。回生胶囊和放疗联合应用，可对抗放疗降低荷瘤小鼠WBC和RBC的作用，与放疗组比较，大剂量组差异有统计学意义（P＜0.05），见表6。
表6 回生胶囊对放疗抗S180肉瘤毒性的影响（
±S）
注：与放疗组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
2.6对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
荷瘤对照组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数降低，正常对照组与荷瘤对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。回生胶囊能增加小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数，与荷瘤对照组比较，大、小剂量组差异有统计学意义（P＜0.05），说明回生胶囊可提高小鼠吞噬细胞的吞噬功能，增强机体非特异性免疫功能，见表7。
表7 回生胶囊对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响（
±S）
注：与荷瘤对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
2.7对小鼠血清溶血素含量的影响（HC50法）
荷瘤对照组小鼠血清溶血素水平降低，正常对照组与荷瘤对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。回生胶囊能提高小鼠血清溶血素水平，与荷瘤对照组比较，大、小剂量组差异均有统计学意义（P＜0.05）。说明回生胶囊能促进小鼠特异性抗体的产生和分泌，增强小鼠的特异性体液免疫功能，见表8。
表8 回生胶囊对小鼠血清溶血素含量的影响（
±S）
注：与荷瘤对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
2.8对小鼠脾脏淋巴细胞转化的影响（MT染色法）
荷瘤对照组小鼠淋巴细胞增殖指数降低，正常对照组与荷瘤对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。回生胶囊能增加小鼠淋巴细胞增殖指数，与荷瘤对照组比较，大、小剂量组差异有统计学意义（P＜0.01），说明回生胶囊能促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应，增强小鼠的特异性细胞免疫功能，见表9。
表9 回生胶囊对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响（
±S）
注：与荷瘤对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
3.结论
对回生胶囊进行小鼠急性毒性实验，因未测出小鼠死亡剂量，无法测定LD50，故改测最大给药量。结果表明小鼠灌胃给药回生胶囊，未发现明显毒性反应，1日最大给药量为42g/（kg·d），是人临床日口服剂量0.09g/（kg·d）的467倍；回生胶囊8.1g、2.7g生药每千克（体质量）给荷瘤小鼠灌胃，对环磷酰胺（CTX）化疗或X射线放疗抗小鼠S180肉瘤有增效作用；8.1g生药每千克（体质量）给荷瘤小鼠灌胃，对CTX或放疗减少S180荷瘤小鼠白细胞和红细胞数有抑制作用；8.1g、2.7g生药每千克（体质量）给荷瘤小鼠灌胃，能提高小鼠吞噬细胞的吞噬功能，增强机体非特异性免疫功能；能促进小鼠特异性抗体的产生和分泌，增强小鼠的特异性体液免疫功能；促进小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应，增强小鼠的特异性细胞免疫功能。
实验表明，回生胶囊1日内过大剂量口服是安全的，与化疗或放疗药物联合应用有增效和减毒作用，同时能增强机体的免疫功能。
参考文献
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（刊登于《西部中医药》2016年第29卷第5期，殷建峰 作，夏小军 主持完成课题）