4.3.3　分子杂交的分类

4.3.3　分子杂交的分类

依据杂交的对象，可以将分子杂交分为核酸分子杂交与蛋白质分子杂交两大类。核酸分子杂交常见的方法有Southern印迹法、Northern印迹法、原位杂交、斑点印迹杂交等，常见的蛋白质分子杂交方法有Western印迹法等。

1.Southern印迹法

（1）Southern印迹法（又叫DNA印迹法、Southern blotting）原理：它是研究DNA的基本技术，在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA样品用限制性核酸内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和，通过毛细作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定后即利用DNA探针进行杂交。附着在滤膜上的DNA与32 P标记的DNA探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。

（2）Southern印迹法操作步骤：①待测DNA样品的制备、酶切；②待测DNA样品的琼脂糖凝胶电泳分离；③利用变性法将凝胶中DNA变性；④Southern转膜，利用硝酸纤维素（NC）膜或尼龙膜来转膜，使用方法有毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法；⑤探针的制备；⑥Southern杂交及杂交结果的检测（图4-5）。

2.Northern印迹法

Northern印迹（Northern blotting）法是一种将RNA分子从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上进行分子杂交的方法，可用于RNA的定性与定量分析。其原理是根据相对分子质量不同的RNA或mRNA在凝胶电泳时迁移速率不同而将其分成大小不同的RNA分子，然后将分开的RNA或mRNA分子转移到尼龙膜或乙酸纤维素膜上，利用特定的标记探针进行杂交并检测，以检出与探针分子特异性结合的RNA或mRNA分子。

Northern印迹杂交技术与Southern印迹杂交技术原理与过程非常相似，不同之处在于Northern印迹检测对象为RNA或mRNA分子，电泳前不需酶切，直接采用变性（用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛等变性剂使RNA变性，而不用NaOH）琼脂糖凝胶电泳分离RNA或mRNA分子（在变性条件下进行电泳，以去除RNA中的二级结构，保证RNA完全按分子大小分离）。再将其转移到尼龙膜或乙酸纤维素膜上，后续步骤与Southern印迹法的相同。

3.原位杂交

将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。根据检测物，分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸，分为DNA/DNA杂交、RNA/DNA杂交、RNA/RNA杂交。原位杂交具有能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究，不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高及能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态等优点。

原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸（探针）与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列，必须具备3个重要条件：进行组织、细胞或染色体的固定；具有能与特定片段互补的核苷酸序列（探针）；有与探针结合的标记物。

4.斑点印迹杂交

斑点印迹（dot blot）杂交法是将被检标本点到膜上，烘烤固定，用已标记的探针进行杂交，洗膜（除去未接合的探针），放射自显影，判断是否有杂交及杂交强度的方法，主要用于基因缺失或拷贝数改变的检测。这种方法耗时短，可进行半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确、方便，市售有多种多管吸印仪（manifolds），它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时膜就可以用于杂交检测。

5.Western印迹法

Western印迹（Western blotting）又称蛋白质印迹或免疫印迹（immunoblotting），是指将蛋白质样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移至固相载体（如硝酸纤维素薄膜）上，然后根据抗原、抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白质，分析基因的表达程度。固相载体以非共价键形式吸附被检测蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽为抗原，与对应的抗体发生免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质成分（图4-6）。免疫印迹由于具有SDS-PAGE的高分辨率和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白质分析的一种常规技术，广泛应用于检测蛋白质水平的表达、鉴定某种蛋白质、蛋白质定性和半定量分析等方面。

与Southern或Northern印迹法相比，Western印迹法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的第二抗体。