4.4.2 PCR反应体系及反应参数的建立
1.PCR反应体系的组成
PCR反应体系除水之外，主要由模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）、二价阳离子（如Mg2+）、缓冲液及一价阳离子等七种基本成分组成。
（1）模板（靶基因）DNA：基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA及mRNA等几乎所有形式的DNA和RNA都可作为PCR的模板。PCR对模板的纯度要求不是很高，CTAB法、SDS法、蛋白酶K法等常规的分子生物学方法制备的样品即可满足，一般不需要另外的纯化步骤。
（2）特异性引物（PCR扩增引物）：指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段，通常由15～30个核苷酸构成。它包括引物1和引物2，即5'端DNA序列互补的寡核苷酸和3'端DNA序列互补的寡核苷酸两种。这两种引物在模板DNA上结合点之间的距离决定了扩增片段的长度。实验表明，1 kb之内是理想的扩增跨度，2 kb左右还是有效扩增跨度，而超过3 kb后就不能够得到有效的扩增，而且较难获得一致的结果。
一般而言，引物设计的正确与否是关系到PCR扩增成败的关键因素。引物如果太短，就可能同非靶序列杂交，而得出非预期的扩增产物。根据概率估算，17个核苷酸所组成的引物平均要在1.5×1010 bp上才会有一个结合位点，其长度超过人类基因组DNA总长度的5倍，所以用17个核苷酸长的引物对人类基因组进行PCR，就有可能获得单一的扩增带。而引物过长往往降低其与横板的杂交效率，从而降低PCR的效率。
引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能设计与其互补的寡核苷酸链作为引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计常采用Oligo、Primer Premier等软件，设计引物一般应遵循以下原则。
①引物长度：与模板严格配对的碱基数，一般为15～30 bp，常用为20 bp左右，上下游引物长度差别一般不大于3 bp。
②引物碱基组成：G+C含量以40％～60％为宜，G+C太少则扩增效果不佳，G+C过多则易出现非特异条带。A、T、G、C最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸成串排列。
③上下游引物的互补性：上下游引物不能有大于3 bp的反向重复序列或自身互补序列存在，以避免引物内部出现二级结构。避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
④引物3'端的碱基：引物3'端的末位碱基对Taq DNA聚合酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基的，因此应当避免在引物的3'端使用碱基A。同时引物3'端的最末及倒数第二个碱基应与模板严格配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑤引物5'端的碱基：引物5'端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。在引物设计好后，也可在引物5'端中引入或加上合适的酶切位点，这对酶切分析、后续载体构建或分子克隆很有好处。为了保护引物5'端的酶切位点，依据内切酶的特点可适当加上2～4 bp的碱基（通常为GC或GGCC）。
⑥引物的解链温度（Tm）：两个引物的Tm值相差最好不要超过2℃，扩增产物与引物的Tm值相差最好不要超过20℃。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。
（3）热稳定DNA聚合酶：热稳定DNA聚合酶是PCR技术实现自动化的关键。目前有两种Taq DNA聚合酶供应：一种是从嗜热水生杆菌中提纯的天然酶；另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶。热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离得到的：一类是嗜热古细菌，其主要的DNA聚合酶属于聚合酶α家族；另一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，其主要的DNA聚合酶类似于中温菌的DNA聚合酶Ⅰ。Taq DNA聚合酶是从嗜热古细菌T.aquaticus中分离到的，也是最先被分离、了解最透彻和最常用的DNA聚合酶。该酶具有以下特点。
①热稳定性好：实验证明在92.5℃、95℃和97.5℃条件下半衰期依次为130 min、40 min和5 min。
②较高的合成速度：在最适反应条件下，每个酶分子每秒钟掺入约150 bp。
③缺乏3'→5'方向的外切酶活性：具有5'→3'方向的聚合酶活性及5'→3'方向的外切酶活性，但缺乏3'→5'方向的外切酶活性，因而无校正功能，使其在一次PCR中造成的核苷酸错误掺入的概率大约是2×10-4。这对于PCR产物分析而言，不会构成什么严重问题，因为错误掺入核苷酸的DNA分子仅占全部合成的DNA分子的极小部分。然而，如果PCR扩增产物用于分子克隆，那么核苷酸的错误掺入是值得重视的。因为每一个克隆都来自单一的扩增分子，如果此种分子含有一个或数个错误掺入的核苷酸，那么在该克隆中所有克隆DNA都将带来同样的“突变”。
但当要求更高保真度、扩增的片段超过几千个碱基对，或者进行逆转录PCR（reverse transcription-PCR）时，最好选用其他的一些热稳定DNA聚合酶，如Vent DNA聚合酶（耐热性好）、Tth DNA聚合酶（持续合成性能好）和Pfu DNA聚合酶等（保真性好），多种热稳定DNA聚合酶已经商品化。现在，也有几家制造商将几种热稳定DNA聚合酶混合成“鸡尾酒”，这种产品能把几种不同DNA聚合酶的特点组合起来。
（4）三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：dNTP是dATP、dTTP、dGTP、dCTP的总称。储备液pH值为7.0左右，其浓度一般为2.0 mmol/L，一般在—20℃环境下保存，多次冻融会使dNTP降解。
（5）二价阳离子（如Mg2+）：所有的热稳定DNA聚合酶在催化DNA合成时都要求有游离的二价阳离子。常用的是Mg2+和Mn2+。一般来说，Mg2+优于Mn2+，由于dNTP和寡核苷酸都能结合Mg2+，因而反应体系中阳离子的浓度必须超过模板DNA、dNTP和引物来源的磷酸盐基团的浓度。由于二价离子浓度的重要性，其最佳浓度必须结合不同的引物与模板用实验方法进行确定，购买的热稳定DNA聚合酶所带的缓冲液一般含有该酶反应所需的二价阳离子。Mg2+浓度以1.5～2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高时，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低时会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
（6）缓冲液：PCR缓冲液通常为10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH值为8.3，20℃），其作用是维持PCR反应体系的pH值。
（7）一价阳离子：标准的PCR缓冲液中一般含有50 mmol/L的KC1，它有利于引物与模板退火，对于扩增大于500 bp长度的DNA片段是有益的。提高KC1浓度到70～100 mmol/L时，对Taq DNA聚合酶有抑制作用。
2.PCR反应体系的建立
标准的PCR反应体系（100μL）如下：
10×扩增缓冲液 10μL
四种dNTP混合物 各20～200μmol/L
引物 各10～100 pmol/L
模板DNA 0.1～2μg（102～105拷贝）
Taq DNA聚合酶 2.0～2.5 U
Mg2+ 1.5 mmol/L
加双蒸水或三蒸水至 100 μL
在上述反应体系中每条引物的浓度以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。加入dNTP时注意四种dNTP的浓度要相等（等物质的量配制），如其中任何一种浓度不同于其他几种（偏高或偏低），就会引起错配，浓度过低又会降低PCR产物的产量。一般根据各试剂的终浓度来确定添加量，至于究竟应该用多大的体系要根据具体情况来确定，常用的有20.0μL、25.0μL、50.0μL等体系。
3.PCR反应参数的选择
（1）温度与时间的设置：基于PCR的变性、退火与延伸三个反应步骤，在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在92～96℃变性，再迅速冷却至40～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100～300 bp时）可采用二温度点法，除变性温度外，退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸（此温度Taq DNA聚合酶仍有较高的催化活性）。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是PCR失败的最主要原因。一般情况下，94～95℃变性1 min足以使模板DNA双链打开，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。为了提高起始模板的变性效果，常在加入Taq DNA聚合酶之前以97℃预变性5～8 min，再按照变性温度进入循环方式。
②退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的。退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。可通过以下公式计算帮助选择合适的引物复性温度：
Tm（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）
复性温度=Tm—（3～10℃）
其中G+C为DNA中胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）的含量，A+T为DNA中腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的含量。
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR的特异性。复性时间一般为30～60s，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：PCR的延伸温度一般选择在70～75℃，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间可根据待扩增片段的长度而定，一般1 kb以内的DNA片段，延伸时间1 min是足够的，3～4 kb的靶序列需3～4 min，扩增10 kb需延伸至15 min。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
（2）循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在25～35。循环次数越多，非特异性产物的量也随之增多，同时会出现PCR扩增平台效应。