4.4.1 PCR的基本原理和反应过程
1.PCR概述
PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）英文首字母的缩写，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为基因工程最常用的技术之一。
PCR技术的发明是基于1971年Korana提出的“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因”核酸体外扩增设想。1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应。Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，此种以Klenow DNA聚合酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于其不耐热，在模板热变性时，会导致其钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作带来了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起足够重视。1988年，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。同年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌（Thermus aquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶最大的特点是耐高温。后将此酶命名为Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）。此酶的发现使PCR被广泛应用。
2.PCR基本原理
PCR基本原理是指模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地扩增DNA某个特殊区域的技术。它是以扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制机制沿着模板链延伸，直至完成新的DNA合成。由于新合成的DNA也可以作为模板，因此PCR可使DNA的合成量以指数的方式增长。
3.PCR过程
PCR过程主要由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成（图4-7）。
图4-7 PCR过程示意图
（1）模板DNA的变性：模板DNA经加热，使模板或经PCR扩增形成的双链DNA打开成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。
（2）模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，降至一定温度时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
（3）引物的延伸：DNA模板与引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原则，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。
变性、退火、延伸三个基本反应步骤不断地重复循环，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。经过2～3 h就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。