技能1 宠物疫病的诊断
宠物疫病常用的诊断方法有临床诊断、流行病学诊断、病理学诊断、病原学诊断、免疫学诊断、分子生物学诊断等，各有特点。实际工作中应根据不同疫病的具体情况，选取一种或几种方法及时做出诊断。
一、临床诊断
临床诊断是利用问诊、视诊、触诊、听诊和叩诊等方法直接对患病动物进行检查，然后根据患病动物在疾病过程中所表现的临床症状、综合特征做出初步诊断或得出诊断印象，为后续诊断奠定基础。有些疾病根据其示病症状就可建立正确诊断。临床诊断是最基本、最常用的诊断方法，操作简单、方便，对任何动物在任何场所均可实施。
狂犬病、犬细小病毒病、犬瘟热等疫病具有特征性的症状，经过仔细的临床检查可得出诊断结果。但是，临床诊断具有一定的局限性，对于患病初期尚未表现特征性症状的疫病，就难以做出诊断。因此，在多数情况下，临床诊断只能提出可疑疫病的范围，必须结合其他诊断方法才能确诊。
二、流行病学诊断
流行病学诊断是针对患病动物群体的一种诊断性调查和病因调查。流行病学调查是应用兽医流行病学的研究方法，对动物群体中存在或出现的疫病现象进行实际调查。了解疫病流行全过程及与流行有关的某些因素，获取相关疫病的第一手感性材料，并对材料进行统计、分析，做出诊断性推理，搞清疫病的特征和严重程度；疫病在动物间、时间、空间的分布规律。分析是什么疫病、可能的感染途径、传播途径及可能的病因，从而科学制订防控措施。
流行病学诊断是在流行病学调查（疫情调查）的基础上进行的。可在临床诊断过程中进行，可向宠物主人询问疫情，并对现场进行仔细检查，然后对调查材料进行统计分析，做出诊断。流行病学调查的内容如下。
1.本次疫病流行的情况 最初发病的时间、地点，随后的情况，发病动物的种类、数量、性别、年龄；感染率、发病率、死亡率和病死率。各种动物的数量和分布情况；疫情扩散、蔓延和分布情况等。
2.疫情来源的调查 本次发病前是否从外地引进过动物、饲料和用具；输出地有无类似的疫病存在；本地过去是否发生过类似的疫病，何时何地发生，流行情况如何；是否确诊，何时采取过哪些防控措施，效果如何；附近地区是否发生过类似的疫病。
3.传播途径和方式的调查 本地各类有关动物的饲养管理情况；动物流动、防疫卫生、检疫情况；发病季节和天气状况；野生动物的分布活动情况；死亡动物尸体处理情况；粪尿处理情况等。
4.本地政治、经济状况及有关人员对疫情的看法等 调查上述内容以推测是否是人畜共患病，疫源地是否在不断扩大等情况。
三、病理学诊断
病理学诊断是选择病死动物尸体或有典型临床症状的患病动物进行解剖检查，观察其病理变化，根据病变部位、大小、形态、颜色、质地及分布等情况，结合疫病特征性的病理变化，做出诊断结论。如犬传染性肝炎、禽流感等的病理变化均有较大的诊断价值。但急性死亡病例，有的特征性病变尚未出现，尽可能多检查几头（只），并选取症状比较典型的进行剖检。有时还需采取特定的器官组织进行病理组织学检查。例如，疑为狂犬病时取大脑的海马角进行包含体检查。
剖检尸体和采集病料时，注意以下几点。
（1）尽可能多剖检几头（只）死亡病例，只有找到共同的特征性病变，才有诊断意义。
（2）剖检前对病死动物尸体进行仔细检查，观察尸体的体表特征及天然孔情况，以排除炭疽等恶性传染病。若怀疑动物死于炭疽，应先采取耳尖血液涂片染色镜检，排除炭疽后方可解剖。
（3）进行尸体剖检越早越好，尸体久放，容易腐败分解，失去诊断价值。须采取病料的应在死后立即进行，夏季不超过5～6 h，冬季不超过20 h。同时最好在白天进行剖检，在灯光下进行会影响对病变颜色的观察。
（4）病料在短时间内不能送到检验单位时，应迅速冷冻保存或用保存液保存。
（5）剖检记录是尸体病理剖检报告的主要依据，也是进行综合分析诊断的原始材料。应在检查过程中做好完整详细的剖检记录，而不是事后补记。
（6）要按程序要求及消毒要求做好有关工作人员的安全防护工作，避免感染；同时防止环境污染。因此，在整个剖检过程中应注意严格消毒。
（7）采取病料、剖检和处置病尸的人员在剖检尤其是在剖检传染病动物尸体时，应穿工作服，外罩胶皮或塑料围裙，戴胶皮手套、工作帽，穿胶鞋，必要时戴上口罩和防护眼镜。手上若有伤口，必须戴双层手套。可用凡士林或其他油脂涂手，以保护皮肤，防止感染。若不慎造成外伤，应立即消毒包扎；如有血液或渗出物溅入眼内，应立即用硼酸水冲洗。剖检过程中，应保持清洁，注意消毒。常用清水或消毒液洗去剖检人员手上和刀、剪等器械上的血液、脓液和各种排出物。剖检后，双手先用肥皂洗涤，再用消毒液浸泡，最后用清水冲洗。剖检器械、衣物和其他可重复使用的物品应用消毒液或其他消毒灭菌方法充分消毒，再用清水洗净。
四、病原学诊断
应用兽医微生物学和寄生虫学的方法找出导致动物感染的病原体，或查明存在于动物周围环境、圈舍、用具，以及饮水、饲料中的病原微生物，以便采取适当措施，将其消灭，切断传播途径。若无法确定宠物疫病的病因，会使人们无法及时做出决策和采取特异性的预防和控制措施。
1.细菌性疫病的诊断方法
（1）病料的采取、保存及运送。采取病料是动物疫病诊断的一个重要环节，也是一项技术性很强的具体工作。病料采取、处理、保存、运送是否合理，直接影响到实验室检查结果的准确性。所以，采取样品要符合规定和要求。
样品采取的全过程均应无菌操作，尤其是供微生物学检查和血清学实验的样品。采样部位、器械、容器及其他物品均需灭菌处理。但有些样品，如皮肤上的水疱用清水清洗即可，忌用消毒剂消毒。同时在采取病料时要防止病原扩散而造成环境污染和人的感染。尽可能采取到新鲜样品，合理采样指取样动物的数量和样品的数量合理。动物群体发病，至少采取5份动物的病料。每一种样品的数量不宜过少，除确保本次实验用量外，还要准备必要的复检用样品。通常，病料的量至少是本次实验检测量的4倍。
（2）采取病料的方法
①液体病料的采取方法。破溃的脓汁、胸水、腹水，以及口腔、鼻腔、阴道分泌物等，一般用灭菌的棉拭子蘸取或注射器抽取后放入无菌试管内，密封送检。采取血液应无菌操作，从静脉或心脏采血，每头（只）每次10 mL，小动物3～5 mL。然后加抗凝剂（10 mL血液加3.8％枸橼酸钠1 mL）；若需分离血清，则采血后（一定不要加抗凝剂），放在灭菌的试管中，摆成斜面，待血液凝固析出血清或用离心机分离后，再将血清析出，置于另一灭菌试管中送检。条件许可时，可直接无菌操作制成液体涂片或接种于适宜的培养基。
②实质脏器的采取方法。应在尸体剖检时立即采取，取病变最明显的部位，取样大小可酌情而定，淋巴结连带周围脂肪一起整体采取。采取的样品分别置于灭菌容器中。
③肠道及其内容物的采取方法。选取要采取的肠管至少6 cm，两端结扎，从结扎线外端稍远处剪断，置于灭菌玻璃容器或塑料袋中。粪便应采取新鲜的带有脓、血、黏液的部分。
④皮肤及羽毛的采取方法。皮肤要取病变明显且带有一部分正常皮肤的部位。被毛或羽毛要取病变明显的部位，并带毛根，放入平皿。
⑤胎儿的采取方法。可将流产胎儿及胎盘、羊水等用不透水塑料袋包紧送往实验室，也可用注射器吸取内容物放入试管送检。
供细菌检验的病料，经冷藏在24 h内能送到的，可冷藏送检，否则应冷冻送检或放入灭菌液体石蜡或30％甘油盐水缓冲保存液中送检。
供细菌学检验的病料最好及时由专人送检，并附有送检单。送检单内容应包括：送检单位、被采样单位、地址，动物品种、性别、日龄、死亡日期、送检日期、联系电话，送检病料的数量、编号、保存方法及检验目的等，并附发病时间、临床表现、病理变化、发病率、死亡率、免疫接种和用药情况等对诊断有帮助的临床病例摘要。
（2）细菌性疫病的检查方法
①镜检法。先对病料进行涂片、染色再镜检（油镜观察细菌的形态结构和染色特性）。在进行病料分离培养前常制作涂片、染色、镜检，以了解细菌的形态、结构和染色特性，大致估计被检材料中可能含有的病原菌和含菌量。例如，对禽霍乱和炭疽的诊断，常通过病料组织触片、染色、镜检即可确诊。常用的染色方法有革兰染色法、亚甲蓝染色法、瑞氏染色法和姬姆萨染色法。而有些细菌需采用特殊染色方法。(https://www.daowen.com)
②培养检查法。细菌在固体培养基上经过培养，长出肉眼可见的菌落。不同细菌形成的菌落其形态、大小、色泽、表面性状、透明度、边缘性状、有无溶血现象等都有所差异。
细菌在液体培养基中生长可使液体出现混浊、沉淀、液面形成菌膜，以及使液体出现变色、产气等现象。因此，从采取的病料中分离出致病性病原菌是细菌病诊断的重要依据，也是对病原菌进一步鉴定的前提。
③生化试验。生化实验是利用生物化学的方法，检测细菌在人工培养繁殖过程中所产生的某种新陈代谢产物是否存在，是一种定性检测。不同的细菌，新陈代谢产物各异，表现出不同的生化性状，这些性状对细菌种属鉴别有重要价值。
一般只有纯培养的细菌才能进行生化试验鉴定。生化试验在细菌鉴定中极为重要，方法也很多，可依据检疫目的适当选择。主要有糖发酵试验、V-P试验、甲基红试验、枸橼酸盐利用试验、吲哚试验、硫化氢试验、触酶试验、氧化酶试验、脲酶试验等。
④动物试验。为了证实所分离的细菌是否有致病性，可进行动物接种试验，最常用的是本动物接种和实验动物接种。目前常用的实验动物有小鼠、大鼠、豚鼠和家兔。实验动物在试验前应编号分组，以便对照。动物接种以后应立即隔离饲养，每日从静态、动态和食态等方面进行观察，做好记录。对发病和死亡的实验动物及时剖检，观察病理变化，并采取病料接种培养基，分离病原体。
2.病毒性疫病的诊断方法
（1）病料的采取、保存和运送。病毒性疫病病料的采取原则、采取方法及保存方法、运送方法与细菌性疫病的基本一致。不同的是，病毒性液体病料采取后可直接加入一定量的青霉素和链霉素或其他抗生素，抑制在采样过程中细菌的污染。病毒病料除可冷冻保存外，还可放在50％甘油磷酸盐缓冲液中保存。
（2）病毒的分离培养。在接到检疫材料时，对组织器官样品、粪便样品等均需经过处理，制成混悬液，取上层液供病毒分离培养，并做除菌处理。除菌方法有过滤器除菌、高速离心除菌和用抗生素处理3种。无菌的体液如腹水、水泡液、脱纤血液等，可以不做处理，直接进行病毒分离培养。
病毒分离培养要求活的组织细胞，常用的方法有：禽胚接种、动物组织培养和动物接种。被接种的动物、禽胚或细胞出现死亡或病变时，可应用血清学试验及相关技术进一步鉴定病毒。
①病毒培养性状观察。病毒在活的细胞内培养增殖后，使易感动物、禽胚、细胞发生病变或变化，能用肉眼或在普通光学显微镜下观察到。根据培养性状，结合被检动物临床表现可做出预测性诊断。
②病毒形态学观察。直接电镜观察是将被检材料经处理浓缩和纯化，用2％～4％磷钨酸钠染色，在电子显微镜下直接观察散在的病毒颗粒，据病毒形态做出诊断。免疫电镜技术是把抗原抗体反应的特异性与电镜的高分辨率相结合而建立的检测技术。将待检样品与抗血清混合后，形成抗原抗体复合物，经超速离心，吸取沉淀物染色，电镜观察。由于抗体会将病毒浓缩在一起，极大地提高了检出率和敏感性。
③病毒核酸检测。检测病毒核酸可达到诊断疫病的目的。目前，最常用的核酸检测方法是聚合酶链式反应（PCR）
（3）包含体检查。狂犬病病毒、伪狂犬病病毒等能在易感细胞中形成包含体。将被检材料直接制成涂片、组织切片或冰冻切片，经特殊染色后，用显微镜检查。狂犬病病毒的包含体即尼氏小体位于神经细胞的胞浆内，用大脑的海马角、小脑或延脑触片，塞勒染色镜检，呈圆形、卵圆形，樱桃红色；而伪狂犬病病毒的包含体位于细胞核内；也有个别病毒的包含体可在细胞核和细胞质内同时存在，如犬瘟热病毒。这种方法对能形成包含体的病毒性传染病具有重要的诊断意义。
（4）动物接种试验。同细菌学检查。取病料或分离到的病毒处理后接种实验动物，通过观察记录动物的发病时间、临床症状及病变甚至死亡的情况；也可借助实验室方法来判断病毒是否存在。
3.寄生虫性疫病的诊断方法
（1）虫卵检查法。虫卵检查主要诊断动物蠕虫病，尤其是寄生在动物消化道及其附属腺体中的寄生虫。被检材料多是动物粪便。
①直接涂片法。先于载玻片中央滴加一滴生理盐水或蒸馏水，再用灭菌环挑起少许粪便，在水滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层，显微镜检查。
粪便直接涂片镜检是最简单的虫卵检查方法，但在粪便中虫卵较少时其检出率不高。
②集卵法检查。集卵法是利用密度不同的液体对粪便进行处理，使粪便中的虫卵下沉或上浮而被集中起来，再进行镜检，以提高检出率。集卵法有水洗沉淀法和饱和盐水漂浮法。
（2）虫体检查法。
①蠕虫虫体检查法。绝大多数蠕虫的成虫较大，肉眼可见；用肉眼观察其形态特征可做出诊断。
幼虫检查法主要用于非消化道寄生虫和通过虫卵不易鉴定的寄生虫的检查法。丝状线虫的幼虫采取血液制成压滴标本或涂片标本，显微镜检查；血吸虫的幼虫需用毛蚴孵化法检查；旋毛虫、住肉孢子虫则需进行肌肉压片镜检。
②蜘蛛昆虫虫体检查法
a.螨虫的检查。病变部剪毛，用锐匙或凸刃小刀，与皮肤垂直刮取皮屑，刮到皮肤微出血为止。把刮取物置于洁净小瓶加塞或直接置于载玻片上，滴加数滴煤油或2％氢氧化钾溶液，使皮屑溶解后进行镜检。
b.蜱等其他昆虫的检查采用肉眼检查法。
c.原虫虫体检查法。原虫大多为单细胞寄生虫，肉眼不可见，需借助于显微镜检查。检查血液原虫常用血液涂片镜检法；检查泌尿生殖器官原虫时可采用直接镜检观察法；检查球虫卵囊时可直接取粪便涂片或用饱和盐水漂浮法检查。检查弓形虫虫体时，可取活体的腹水、血液或淋巴结穿刺液涂片，姬姆萨染色，镜检，观察细胞内外有无滋养体、包囊，或尸体剖检时取脑、肺、淋巴结等组织做触片，染色镜检，检查其中的包囊、滋养体。也可取死亡动物的肺、肝、淋巴结或急性病例的腹水、血液作为病料。接种于小白鼠的腹腔，观察其临床表现并分离虫体。
五、免疫学诊断
免疫学诊断是诊断传染病和检疫常用的重要方法，有血清学检测技术和变态反应两类。
1.血清学检测技术 血清学检测技术是利用抗原和抗体特异性结合的免疫学反应进行诊断，具有特异性强、检出率高、方法简易快速等特点。操作简单的有凝集反应、沉淀反应；操作较为复杂的有补体结合反应、中和试验；亦有广泛应用在疫病诊断中的免疫标记技术等。这些技术都是建立在抗原抗体反应的高度特异性基础之上的。可以用已知抗原来测定被检动物血清中的特异性抗体，也可以用已知抗体来测定被检材料中的抗原，以达到检测目的。
2.变态反应 分枝杆菌、布氏杆菌等细胞内寄生菌，在传染的过程中能引起以细胞免疫为主的V形变态反应，称为传染性变态反应。临床上用已知的变应原（过敏原）给动物点眼或皮下、皮内注射，观整动物是否出现特异性变态反应，进行变态反应诊断。如用结核菌素给动物皮内注射，然后根据局部炎症情况判定是否感染结核病。
六、分子生物学诊断
分子生物学诊断又称为基因诊断，主要针对不同病原微生物所具有的特异性核酸序列和结构进行测定，其特点是反应的灵敏度高、特异性强、检出率高，是目前最先进的诊断技术。
1.PCR PCR又称为聚合酶链式反应，是20世纪80年代中期发展起来的一项极有应用价值的技术。PCR有逆转录PCR（RT—PCR）、免疫PCR等。此项技术具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、重复性好和对原材料要求较低等特点。它尤其适于那些培养时间较长的病原菌的检查，如结核分枝杆菌、支原体等。PCR的高度敏感性使该技术在病原体诊断过程中极易出现假阳性，避免污染是提高PCR诊断准确性的关键环节。
2.核酸杂交技术 由于每一种病原体都有其独特的核苷酸序列，所以应用一种已知的特异性核酸探针，就能准确地鉴定样品中存在的是何种病原体，进而做出疾病诊断。核酸杂交技术敏感、快速，特异性强。
3.核酸分析技术 核酸分析技术包括核酸电泳、核酸酶切电泳、寡核苷酸指纹图谱和核苷酸序列分析等技术，它们都已开始用于病原体的鉴定。如疱疹病毒等DNA病毒，经限制性内切酶切割后电泳，根据呈现的酶切图谱可鉴定出所检病毒的类型；轮状病毒、流感病毒等RNA病毒，由于其核酸具多片段性，故通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其基因组型，便可做出快速诊断。
