二、材料与方法

二、材料与方法

（一）实验材料

1.细胞株

HCT-116细胞株购自中国科学院细胞库（上海）。

2.主要试剂

主要试剂见表5-2-1。

3.主要仪器设备

主要仪器设备见表5-2-2。

4.主要耗材

细胞培养瓶、离心管、冻存管、12孔板、6孔板均购自美国Corning公司。

（二）实验方法

1.主要溶液的配制

1）细胞培养相关溶液

（1）细胞培养液：100 mL RPMI-1640培养基加入10 mL胎牛血清。

（2）磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 8.0 g、KCl0.2 g、KH2PO40.24 g及Na2HPO4 1.44 g，溶于800 mL双蒸水中，调整pH值为7.4，然后定容至1000 mL，分装，高压灭菌。

2）蛋白质印迹法相关溶液

（1）苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液：称取PMSF 0.01 g，溶于1 mL异丙醇中，置于-20℃保存。

（2）5×蛋白上样缓冲液：预先取1.5 mol/L（pH 6.8）三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）2.5 mL、溴酚蓝0.025 g、二硫苏糖醇（DTT）0.39g、甘油2.5 mL、十二烷基硫酸钠（SDS）0.5 g。将Tris-HCl加入溴酚蓝中，过滤后，再依次加入甘油、SDS和DTT，并定容至5 mL。

（3）5×电泳缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）7.55 g、SDS 2.5 g、甘氨酸（Gly）47 g，并溶于450 mL双蒸水中，调整pH值为8.3，定容至500 mL，置于常温保存。

（4）25×电转缓冲液：称取Gly 90 g、Tris 18.2 g，并溶于450 mL双蒸水中，调整pH值为8.3，定容至500 mL，置于常温保存。

（5）1×电转缓冲液：取甲醇100 mL、25×电转缓冲液20 mL，溶于380 mL双蒸水中，定容至500 mL，置于常温保存。

（6）10％或5％封闭液：称取吐温-20100μL（或50μL）、脱脂奶粉1g（或0.5 g），溶于10 mL Tris缓冲盐溶液（TBS）中，置于-20℃保存。

（7）30％聚丙烯酸（PAA）溶液：称取双丙烯酰胺（Bis）1 g、丙烯酰胺（Arc）29g，溶于60 mL双蒸水中，定容至100 mL，置于棕色瓶中避光常温保存。

（8）10％过硫酸铵（AP）溶液：称取AP0.1 g、溶于1 mL双蒸水中，避光于4℃保存。

（9）10×TBS：称取NaCl 40.9g、Tris-Base 12.1 g，溶于450 mL双蒸水中，调整pH值为7.6，定容至500 mL，常温保存。

（10）TBST（Tris buffered saline tween）：量取吐温-200.15 mL、10×TBS 15 mL，溶于双蒸水中，定容至150 mL，常温保存。

（11）10％SDS溶液：称取SDS 5 g，溶于45 mL双蒸水中，调整pH值为7.2，定容至50 mL，常温保存。

（12）1.5 mol/L Tris溶液：称取Tris 9.08g，溶于40 mL双蒸水中，调整pH值为8.8，定容至50 mL，常温保存。

（13）7 mol/L NaOH溶液：称取NaOH 28g，溶于100 mL双蒸水中。

（14）1 mol/L Tris-HCl：称取Tris 6.055 g，溶于40 mL双蒸水中，调整pH值为6.8，定容至50 mL，常温保存。

（15）脱色液：量取乙酸10 mL、甲醇30 mL，溶于60 mL双蒸水中。

（16）10×丽春红染液：称取三氯乙酸30 g、丽春红2g、磺基水杨酸30 g，溶于80 mL双蒸水中，定容至100 mL。

（17）考马斯亮蓝（G250）溶液：取95％乙醇50 mL、G250100 mg、磷酸100 mL，配制时先用95％乙醇溶解G250，再加入磷酸和双蒸水共950 mL，混匀后，定容至1000 mL，过滤后4℃保存。

2.STAT3 siRNA与STAT3质粒转染细胞

将STAT3 siRNA与STAT3质粒分别溶于100μL无血清的RPMI-1640培养基中，混合均匀。将适量Lipofectamine 2000溶于100μL无血清的RPMI-1640培养基中。在室温下静置5 min后，将上述两种混合物分别与Lipofectamine 2000混合，轻轻混匀，在室温下孵育15 min。在加有细胞的6孔板中每孔加入200μL复合物以及适量培养基，十字法混合均匀，4～6 min后更换普通培养基，在孵箱中培养18～36 h，测量转染效率。

3.RT-PCR检测AKT表达

1）RNA提取

（1）在预先处理好的HCT-116细胞中，加入1 mL TRIzol试剂，置于匀浆器中匀浆。

（2）加入200μL氯仿，轻轻颠倒数次混匀，室温下放置5 min。

（3）12000 r/min、4℃离心15 min。

（4）转上层水相至一支新的1.5 mL离心管中，加入400μL异丙醇，混合均匀，室温下静置10 min。

（5）12000 r/min、4℃离心10 min。

（6）弃上清液，将沉淀用预冷的70％乙醇洗3次，置于空气中干燥5～10 min，溶于20μL DEPC溶液中。

（7）用分光光度计测定RNA浓度。

2）RT-PCR

（1）逆转录形成cDNA：各样品取相同量的RNA做逆转录。

RNA反应体系见表5-2-3。

反应条件为70℃5min，短暂离心后放置于冰上。然后按表5-2-4所示加入各反应液，反应条件为42℃60min、95℃5min，合成cDNA。

（2）RT-PCR。

RT-PCR引物设计如下所示。

Actin 284 bp

β-actin F：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'

β-actin R：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'

Homo-AKT 113 bp

Homo-AKT F：5'-GCACCTTCCATGTGGAGACT-3'

Homo-AKT R：5'-CCCAGCAGCTTCAGGTACTC-3'

RT-PCR反应体系见表5-2-5。

反应条件为94℃4min；94℃30s、56℃30s、72℃25s，30个循环；72℃4min，4℃4min。

4.蛋白质印迹法检测蛋白质表达量

1）细胞蛋白的提取

用预先设计好的不同浓度顺铂孵育结肠癌细胞0、3h、6h、12 h及24 h后，用PBS轻洗细胞2次，用1 mL胰蛋白酶消化细胞，并吹散细胞后转入1.5 mL离心管中，1000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞沉淀，然后加入100μL裂解液、1.742μL PMSF蛋白酶抑制剂重悬细胞，用移液器吹打细胞至混匀，使裂解液与细胞充分接触。置于冰上裂解约45 min，后12000 r/min、4℃离心30 min，吸取上清液，将样品分装至预冷的离心管中，-80℃保存。

2）细胞蛋白浓度测定

采用BCA蛋白浓度测定试剂盒来检测蛋白的浓度。首先取1.2 mL蛋白标准配制液加入蛋白标准BSA中，预先充分溶解后配制成25 mg/mL的蛋白标准溶液。取适量25 mg/mL蛋白标准溶液，用0.9％NaCl溶液或PBS稀释至终浓度为0.5 mg/mL。然后根据样品数量，将BCA试剂盒中的A与B按体积比50∶1均匀混合，并配制适量BCA工作液。将标准品按照0、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL及20μL的顺序分别加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL。各孔中加入200μL BCA工作液，37℃放置20～30min。在波长540～595 nm处测定吸光度，并根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。

3）电泳

（1）配制SDS-PAGE凝胶：预先将玻璃板洗净并干燥后安装入BioRad垂直电泳槽，配制10％分离胶溶液（表5-2-6），均匀混合后将其灌注于玻璃板间隙中，加入1 mL无水乙醇封胶，常温放置30～60 min，待分离胶聚合完全，吸去覆盖层的无水乙醇，吸尽封胶液。配制3％积层胶溶液（表5-2-7），将混匀好的积层胶灌注于分离胶之上，将预先洗净的梳孔直径为1.5 mm的BioRad梳子插入其中。待积层胶完全凝固后，小心拔出梳子，后用无水乙醇冲洗并整理梳孔，并在电泳槽内加入1000 mL1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

（2）蛋白样品的制备与电泳：将预先处理好的蛋白上清液按4∶1的比例与5×蛋白上样缓冲液混匀，100℃水浴5 min。根据蛋白浓度，每孔按照上样45μg蛋白，计算出需要上样的蛋白溶液体积。上样时加2μL蛋白预染Marker作为标准参照。

接通电泳仪，以室温、100 V恒压电泳，直至溴酚蓝到达分离胶底部，停止电泳。

（3）转膜：电泳完毕后取出凝胶，依据蛋白Marker来判断目的蛋白的位置，并依此切取所需部分凝胶，标记好凝胶方向。后剪与凝胶大小相同的1张NC膜和3张滤纸，然后将膜、滤纸和凝胶置于转膜缓冲液中平衡约15 min。同时将两块海绵垫板置于转移缓冲液中浸泡15 min，并轻轻用玻璃棒挤压以排尽垫板中的气泡。然后按照滤纸、凝胶、NC膜、滤纸的顺序逐层叠放对齐，每层放置时用玻璃棒赶尽气泡，后加盖槽芯的正极板。在电转槽内加入1000 mL 1 ×电转缓冲液，冰浴中恒流220 mA并根据蛋白质分子量不同设置不同时间，取出NC膜。

（4）蛋白抗体结合：转膜结束后取出NC膜，首先观察预染Marker的电转效果进而判断样品的电转效果。将NC膜置于1× TBST中漂洗3次，每次约10 min。后用配制好的封闭液缓慢摇动，室温封闭2h。用1×TBST将膜漂洗3次，每次10 min；加入1∶1000稀释的兔抗人单克隆抗体（一抗）AKT、STAT3、p-STAT3、p-AKT于封闭液中，在摇床上摇动孵育过夜。孵育结束后，用1× TBST漂洗NC膜3次，每次10 min，再加入用适量5％封闭液1∶1000稀释的二抗，室温下轻摇1h，后用1×TBST漂洗NC膜3次，每次10 min。

（5）显影与曝光：取出预先洗涤好的NC膜，用滤纸小心吸干，置于ECL发光剂中显色，使膜蛋白面朝下与混合液充分接触，将其密封于两层保鲜膜之间，将杂交膜转印有目标蛋白的一面朝上，置于X线片压片夹中。开始曝光时，根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为30 s～30 min。曝光完成后，在暗室中打开X线片压片夹，取出X线片并迅速浸入事先配制好的显影液中显影，待出现条带后，即刻终止显影，并将X线片浸入定影液中，直到胶片透明为止。上述实验步骤重复3次。

5.染色质免疫共沉淀法检测STAT3调控AKT启动子

1）染色质免疫共沉淀法（chromatin immunoprecipitation，CHIP）的原理

CHIP是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。其可以较灵敏地检测目标蛋白与特异DNA片段结合的情况，可以用来研究组蛋白与基因表达之间的相互关系。核小体组蛋白可以发生多种翻译后的共价修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，这些共价修饰与真核基因的表达之间关系密切。因此，CHIP也为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用、全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。真核生物细胞状态是由内源性和外源性刺激因素共同影响的，而所有信号转导途径的终点均是DNA。DNA通过核蛋白复合物组成染色质，对于染色质来说其是基因调控的非常重要的位点。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧基端修饰的确定，组蛋白密码在控制和调节基因功能过程中的作用也越来越明确。参与修饰的酶根据其作用的不同而分类，如组氨酸乙酰转移酶（HATs）可以将乙酰基团转移到组蛋白上；组蛋白去乙酰酶（HDACs）可以去除氨基酸上的乙酰基团；组蛋白甲基转移酶（HMTs）可以将甲基基团转移到组蛋白上。相对而言，组蛋白的甲基化修饰是最稳定的表观遗传。另外，还有其他不稳定的修饰方式，如磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等。这些修饰方式更为灵活地影响染色质的结构与功能，通过多种修饰方式的组合发挥调控功能。

该方法主要应用于转录调控分析、药物开发研究、有丝分裂研究、DNA损失与凋亡分析。

2）试剂盒组分

（1）单链DNA/蛋白A琼脂糖。

（2）单链DNA/蛋白G琼脂糖。

（3）染色质免疫沉淀稀释缓冲液。

（4）低盐洗涤缓冲液。

（5）高盐洗涤缓冲液。

（6）氯化锂洗涤缓冲液。

（7）TE缓冲液。

（8）0.5 mol/L EDTA溶液。

（9）5 mol/L氯化钠溶液。

（10）1 mol/L Tris-HCl，pH值为6.5。

（11）SDS裂解缓冲液。

3）步骤

（1）细胞裂解，交联及断裂DNA：在预先处理好的细胞中加入甲醛（将500μL甲醛加入10 mL培养瓶中，轻摇至混匀，室温下静置15 min），取一支新的离心管，加入10×Glyline终止反应。振荡摇晃，静置10 min。加入1×PBS、蛋白酶抑制剂混合液（protease inhibitor cocktail），用细胞刮刮下细胞，离心后，静置5 min。离心去上清液，加入SDS裂解缓冲液、蛋白酶抑制剂混合液，将混匀后的液体放置5 min，匀浆机上裂解染色质。

（2）染色质免疫沉淀反应。

取上清液约50μL，转移5μL至另一新的预先准备好的离心管中作为输入对照。在剩下的45μL上清液中加入450μL的1× CHIP稀释缓冲液，混匀。在3个样品管中加入适量一抗，阳性对照是加入10μL抗RNA多聚酶二抗，阴性对照是加入2μL正常兔IgG。置于摇床4℃孵育过夜，加入蛋白G琼脂糖振荡摇晃，瞬时离心，吸取上清液到一新的离心管，分别滴加抗体，4℃旋转过夜，每个反应管中加入20μL琼脂糖树脂，混合均匀，置于摇床上，在4℃条件下孵育约1h。孵育后，将整个反应体系转入2 mL的含有离心柱的收集管中。3000g离心30 s，弃去收集管中的液体，将离心柱重新放入收集管中，依次用500μL的（1～3）×CHIP洗涤缓冲液洗离心柱，置于摇床上，在4℃条件下孵育10 min，3000g离心30 s，弃去收集管中的液体，加入蛋白激酶K，解除交联后，往离心柱中加入150μL 1×CHIP洗脱缓冲液，并对树脂进行洗涤。放置于65℃孵育30 min，同时，在操作过程中溶解输入对照样品。取出另外一支新的1.5 mL离心管，加入5 mol/L的NaCl溶液6μL、20 mg/mL蛋白激酶K2μL，65℃孵育后，将离心柱从热板上取出，放在加有6μL5mol/L的NaCl溶液和2μL 20 mg/mL的蛋白激酶K的1.5 mL离心管中，6000g离心1 min。离心结束后，弃掉离心柱，盖好离心管后，漩涡振荡，置于预先设置好的水浴箱中孵育2h，得到的DNA进行PCR检测。

（3）DNA纯化与回收：孵育结束后，继续往每个反应管与输入对照管中加入750μL DNA结合缓冲液，混合均匀。先吸取500μL混合液加入2 mL DNA纯化柱内，室温下放置1 min，12000 r/min离心1 min，弃去收集管内的液体，将剩余的样品加入对应的离心柱内，离心，弃去收集液。往离心柱内加入750μL DNA柱洗涤缓冲液，室温下放置1 min，10000 r/min离心1 min，弃去收集管中液体，再次离心2 min，弃去离心柱内残留液体。将DNA纯化柱置于新的1.5 mL离心管中，加入50μL的DNA柱洗脱液至管内柱面上，放置1 min，10000 r/min离心1min。取纯化好的DNA采用RT-PCR进行检验。

（4）PCR：AKT引物序列F 5'-CTTCGTGAACATTAACGA-CAGGGCC-3'，R 5'-AATGGCCACCCTGACTAAGGAGTGG-3'。

Actin引物序列F 5'-GATCCATGGGTAGGAACAACACCATGG-3'，R 5'-TTCCCAGCCTCCCTAACCTAACCTGATGC-3。

（三）统计学处理

用SPSS 11.7软件进行统计学分析，多个样本之间的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。