第六章　综述——增强化疗药物敏感性的研究进展

由于肿瘤细胞本身具有独特的生物学特性，任何治疗肿瘤的方法必须要充分考虑这些生物学特性，以保证在尽可能杀伤肿瘤细胞的前提下减少毒副作用的产生。基因毒素类化疗药物（如顺铂）是目前临床上比较常见的化疗药物，但因较严重的毒副作用和耐药性而限制了其在临床上的进一步应用。通过前期实验我们发现，在应用顺铂杀伤肿瘤细胞时内源性ROS发生异常聚积，并促使下游信号通路发生变化，抑制肿瘤细胞凋亡，从而降低化疗药物的杀伤效果。以下对顺铂耐药性形成的可能机制、ROS产生及其发挥抗凋亡作用的机制进行综述。

一、基因毒素类化疗药物顺铂发挥抗肿瘤作用的机制

1979年顺铂被首次报道用于治疗睾丸癌、卵巢癌、头面部及颈部肿瘤等实体性癌。顺铂主要依靠损伤DNA来发挥治疗作用，而这种损伤机制包括以下四个方面：①抑制DNA合成；②抑制RNA转录；③调控细胞周期；④促进肿瘤细胞凋亡。临床应用顺铂的关注点是如何增强顺铂的治疗效果，而耐药性往往是限制其疗效的关键所在。Ozols等学者发现使用顺铂治疗卵巢癌时，在使用初期治疗效果非常显著，但是随着使用时间延长，产生的耐药性问题导致治疗效果不佳，卵巢癌患者的5年生存率仅有15％左右，因而顺铂的耐药性成为亟待解决的问题。

顺铂又名顺式-二氯二氨合铂，是一种含铂的抗癌药物，可与DNA链交叉连接，从而破坏DNA的功能，并抑制细胞有丝分裂，为一种细胞周期非特异性药物。其主要与亲核DNA中的嘌呤碱基N7位点发生反应，从而形成DNA-蛋白质、DNA-DNA链间和链内交联等复合物形式。目前研究表明，1，2-链内ApG与GpG交联是DNA复合物的主要存在形式，此链内加合物可以诱导细胞损伤，此种形式导致的细胞损伤占细胞损伤总量的85％～90％。有报道发现，在肿瘤细胞中存在一种类似于链内交联DACH-硫酸根-铂的复合物，此复合物与其他复合物在DNA碱基对的数量上存在区别。由于形成的链内加合物可使大量顺铂诱导细胞核损伤，因此，顺铂与DNA结合水平的高低决定了顺铂所产生的细胞毒性的严重程度。顺铂可影响DNA复制，但其影响DNA合成的作用与其细胞毒性严重程度之间无直接相关性。最近有研究发现，顺铂与DNA结合可引起交叉连接，从而破坏DNA的功能导致细胞凋亡的发生。此过程涉及许多细胞信号通路，有超过20种蛋白质参与其中，这些蛋白质发生结合并导致DNA出现物理性扭曲，从而导致链内加合物的产生。该过程中存在一些具有识别损伤部位功能的蛋白质，包括hMSH2、hMutSα错配修复（MMR）复合物、非组蛋白染色体高速泳动族B1和B2（HMG B1和HMG B2）蛋白、人RNA聚合酶、上游结合因子（hUBF）和转录因子的TATA结合蛋白（TBP）等。由于针对这些蛋白质的研究较少，因此无论是单一蛋白质还是它们之间相互组合形成的蛋白质来进行调控的损害机制，目前仍然有待进一步研究。Zdraveski等研究发现，MMR复合物和HMG1蛋白诱导奥沙利铂和JM216产生铂类复合物，而不产生链内加合物。DNA损伤信号激活DNA损伤识别蛋白，进一步转导激活其下游效应信号通路。除此之外，这些蛋白质还具有其他生物学功能，比如，HMG1蛋白与DNA复合物发生相互作用，导致细胞毒性的产生，降低DNA修复水平。在顺铂作用于乳腺癌细胞时，亦发现HMG1蛋白表达水平上调；同样，hUBF和TBP通过介导RNA聚合酶1来调控转录的发生。顺铂作用于肿瘤细胞，促凋亡与抗凋亡信号同时被激活，并介导调控下游效应信号通路的分子，最终产生不同的生物学效应，导致肿瘤细胞对顺铂产生耐药性。

二、AKT蛋白家族结构特征

AKT蛋白家族包括AKT1、AKT2及AKT3，它们在氨基酸结构组成上具有很高的同源性。AKT1和AKT2在生物体内分布广泛，而AKT3只在特定的组织内分布。AKT家族成员均含有PH结构域、激酶催化结构域和调控结构域。细胞外刺激如生长因子、细胞因子和应激反应均可以激活AKT；细胞内酪氨酸激酶受体的改变也可以激活AKT，进而调控细胞生长、分化及代谢。AKT的活化依赖PH结构域的完整性，PH结构域大约由100个氨基酸组成。与PH结构域相邻的是激酶催化结构域，该结构域中含有一个苏氨酸残基，其磷酸化是激活AKT的关键步骤。AKT信号通路同时参与调控肿瘤的发生和发展。位于AKT C端的是一个疏水性调节结构域，该结构域含有磷酸化位点，Ser473在外源性应激原或细胞因子的刺激下发生磷酸化，从而促使AKT活性增高。如Thr308发生磷酸化，则可部分激活AKT，但是如果该位点连同位于疏水性调节结构域的Ser473同时发生磷酸化，则AKT的活性最强。Ser473发生磷酸化的具体机制还有待进一步研究。另外，AKT在细胞内的位置变化对其功能具有非常重要的影响，比如，在静息状态下AKT主要位于细胞质中；在活化状态下AKT在细胞膜上被激活，随即转位到细胞核中，并通过与靶向基因相互结合来调控细胞应答。

AKT可通过直接调控抗凋亡蛋白的表达来调控细胞的凋亡过程。另外，它还可以通过直接磷酸化凋亡级联反应中的调节蛋白来抑制细胞凋亡。目前研究最多的级联调节蛋白是Bad蛋白，该蛋白质是B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）蛋白家族中的一个促凋亡成员。Bcl-2蛋白家族包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL、Bclw、A1和Mcl-1）和促凋亡蛋白（如Bax、Bcl-X、Bak、Bad和Bid）等。AKT可以通过直接或间接两种方式来参与调控Bad蛋白的功能，具体来说是在Raf-1介导下磷酸化Bad蛋白的Ser136位点，磷酸化后的Bad蛋白具有抗凋亡作用。值得注意的是，Bad蛋白只在部分肿瘤细胞中表达，因此该方式不具有普遍性。细胞受到应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）等刺激后会发生凋亡，如MAPK蛋白家族中的JNK在促进细胞凋亡的过程中发挥重要作用，而AKT可以通过调控SAPK信号通路来起到抑制细胞凋亡的作用。凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）是一种MAPK，其在细胞因子诱导的细胞凋亡中起关键作用。在JNK-MAPK P38信号通路中，AKT介导ASK1发生磷酸化并使其活性减弱，进而阻断该信号通路并抑制细胞凋亡的发生。有研究显示，AKT可调控线粒体释放细胞色素c后的级联反应过程，如procaspase-9是caspase级联反应的一个起始酶，同时也是AKT的一个作用底物，AKT可磷酸化procaspase-9并导致后者活性减低，从而中断了下游的信号转导过程，进而抑制细胞凋亡。

三、顺铂耐药性机制分析

（一）促进DNA损伤的修复

顺铂促使DNA复合物的形成对于促进肿瘤细胞凋亡发挥了至关重要的作用，提高DNA复合物的修复率会抑制肿瘤细胞发生凋亡。有研究通过不同种属的肿瘤细胞实验发现，抑制药物产生的细胞毒性后，提高DNA复合物的修复率可以抑制肿瘤细胞发生凋亡。在发生耐药性的肿瘤细胞中，DNA复合物的自我修复率往往较低。然而，当这种自我修复机制存在时，尽管其修复率低下，肿瘤细胞对顺铂产生耐药性的发生率也比没有该功能时高1.5～2.0倍。长时间使用顺铂时，DNA复合物的自我修复率增高的幅度不大，从而导致这种修复机制产生的调节作用有限。

DNA修复途径中的核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）、错配修复、碱基切除修复等均与肿瘤细胞对铂类药物产生耐药性有关，而NER通路被认为是机体内修复DNA损伤的最主要途径。NER通过识别损伤位点，将包含全基因组的核苷酸切除来进行修复。NER主要修复那些影响区域性染色体结构的DNA损害，包括DNA复合物和DNA交互连接。NER的主要作用在于发现细胞信号通路中存在的缺陷，并且恢复NER的完整性，从而增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性。NER具有特异性，由于顺铂诱导产生的复合物与其他铂类药物诱导产生的复合物在功能与结构上没有差别，DNA复合物修复机制在其他铂类药物应用时同样存在，所以这种修复机制的存在是铂类药物产生耐药性的主要原因之一。NER涉及的复合物包含17种不同的蛋白质，但在化疗药物耐药性的细胞研究中发现，仅有少数蛋白质参与切除修复机制。切除修复交叉互补组1（excision repair cross-complementation group 1，ERCC1）基因是NER的主要成员，研究发现，ERCC1的表达水平与肿瘤细胞对顺铂的敏感性存在负相关，ERCC1基因多态性是ERCC1表达水平的主要影响因素，不同基因型的ERCC1在肿瘤细胞中表达效率及高低不同，ERCC1基因多态性与铂类药物疗效间存在相关性。ERCC1基因多态性可改变ERCC1的DNA修复能力，其118密码子C＞T的突变定义为无义突变，即密码子AAC和AAT均编码天冬酰胺（asparagine，Asn）。但有研究发现，该无义突变能影响ERCC1蛋白的表达水平。T等位基因携带者的ERCC1 mRNA水平更高，DNA修复能力更强，可引起患者对铂类药物的敏感性下降，药物疗效降低。

顺铂是临床上广泛应用的一种抗癌药物，它含有一个铂原子、两个氯原子和两个氨分子，是一种无机络合物，结构很简单。顺铂通过与肿瘤细胞中的DNA结合，形成链内、链间连接，影响DNA的功能，干扰DNA复制、转录，并激活P53信号通路，诱导肿瘤细胞发生凋亡。目前有研究发现，P53通过调控Bcl-2基因的表达来诱导肿瘤细胞发生凋亡，从而达到治疗目的。Bcl-2蛋白家族成员均含有数量不等的同源结构域，即BH（bcl-2 homology）结构域，该结构域在结构上与α螺旋有关。Bcl-2家族大体分为三大类：①促凋亡蛋白，Bax、Bak；②抗凋亡蛋白，Bcl-2、Bcl-w；③BH3-only蛋白。Bcl-2蛋白含有3～4个BH1～BH4结构域，该结构域不具备酶的催化活性，但可发挥调控靶向蛋白的作用。BH3-only蛋白仅有BH3结构域，因此被称为BH3-only蛋白。该蛋白在凋亡反应中不能独立发挥作用，其需要Bax和Bak等成员共同协作，因此在凋亡反应过程中仅仅发挥信号转导作用。BH3-only蛋白将不同种类的刺激信号传递给Bcl-2蛋白家族的其他成员，进而调控细胞生物学功能。另外，BH3-only蛋白通过翻译后修饰及调控蛋白转录等不同机制来调控细胞生物学功能。Bax和Bak两种蛋白质是促凋亡家族中的主要成员，其在细胞凋亡通路中发挥着重要的作用。另外，有研究发现，Bak和Bax是影响线粒体外膜通透性改变的关键蛋白质，均可促进细胞发生凋亡。Bax的结构域与Bcl-2的结构域具有一定的相似性，均含有1个BH1～BH3结构域并形成疏水沟样结构。如果其他蛋白质中的BH3结构域与疏水沟样结构发生反应，可结合形成一个寡聚体。Bax蛋白还具有介导调节蛋白的膜定位结构域和C端疏水结构域的作用。在某些特殊情况下，Bax蛋白C末端被释放并转移到线粒体外，可导致细胞发生凋亡。

（二）过表达HER-2/neu和PI3K/AKT的途径

人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2/neu）又称lien、c-erbB-2或P185。20世纪80年代，Her-2/neu原癌基因由三个研究小组分别独立发现，分子量为185000，其为具酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，编码基因定位于人染色体17q21，是表皮生长因子受体家族的成员。Her-2/neu原癌基因编码一种跨膜受体酪氨酸激酶，该酶由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三个部分组成，具有广泛的同源性表皮生长因子受体。HER-2/neu在细胞增殖、分化及血管生成等过程中发挥重要作用，其高表达可加速细胞分裂，使其增殖、分化过程失衡，最终转变为肿瘤细胞。此外，有研究发现HER-2/neu高表达可提高肿瘤细胞的迁移率、体外侵袭率和Ⅳ型胶原酶活性，且可干扰黏附分子合成，从而促进肿瘤侵袭、转移和复发。目前研究在20％～30％的乳腺癌和卵巢癌患者中发现HER-2/neu基因，该基因扩增和过度表达会导致化疗药物治疗后效果不佳。此外，有报道发现HER-2/neu基因在很多其他类型的上皮起源肿瘤中过度表达，如肺癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌和膀胱癌。如果用带有HER-2/neu基因的质粒转染肿瘤细胞，肿瘤细胞会产生耐药性；相反，使用活性酪氨酸激酶抑制剂减弱p185或使用HER-2/neu受体拮抗剂，均可抑制顺铂的细胞毒作用，其原因在于减弱了顺铂-DNA复合物的修复作用。有研究发现，激活p185酪氨酸激酶后，HER-2/neu受体被激活，并可激活SHC/GRB2/SOS信号通路及PI3K/AKT信号通路。PI3K/AKT信号通路失调见于多种疾病，包括消化道肿瘤、糖尿病、心血管疾病和神经系统疾病。在消化道肿瘤中，研究者已发现两处可增强PI3K内在激酶活性的突变。另外，该信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。近年来研究发现，PI3K和其下游分子蛋白激酶AKT所组成的信号通路可调节肿瘤细胞的增殖和存活，其活性异常不仅能导致细胞恶性转化，而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关，目前以PI3K/AKT信号通路的关键分子为靶点的肿瘤治疗策略正在研究中。顺铂通过促使p21WAF1/CIP1的产生来调控PI3K/AKT信号通路。p21WAF1/CIP1是第一个被发现的CDI家族成员，又名CDK相互作用蛋白1（CDK-interacting protein 1，CIP1）、野生型p53激活性片段1（wildtype p53 activated fragment 1，WAF1）、CDK相关蛋白20（CDK-associated protein 20，CAP20）和黑色素瘤分化相关基因6（melanoma differentiation associated gene 6，mda 6）。该基因编码的蛋白质是一种细胞周期依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）的抑制蛋白，它通过p53依赖和p53非依赖两种途径参与细胞生长、发育、分化、衰老及DNA损伤修复等多种功能的调节。p21WAF1/CIP1为具有广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白，能与cyclin-CDK结合，使cyclin-CDK复合物的激酶活性丧失，细胞周期停滞在G1期。

研究发现，HER-2/neu过度表达可增强AKT的活性，这与p21WAF1/CIP1第145位的苏氨酸发生磷酸化有关，进而导致细胞核中的p21WAF1/CIP1表达水平下调，增强了顺铂的促凋亡作用。同样，p21WAF1/CIP1可以根据上游信号的强弱，来增高或降低PI3K/AKT的活性。此外，AKT促进MDM2蛋白磷酸化并进入细胞核，而MDM2减弱p53蛋白的活性，导致肿瘤细胞对顺铂产生耐药性。

p38蛋白激酶是最早由Brewster等在研究高渗环境对真菌的影响时发现的一种激酶。随后研究发现其也存在于哺乳动物的细胞内，是MAPKs的亚类之一，其性质与JNK相似，是一种应激激活的蛋白激酶。已发现p38蛋白激酶有5个异构体，分别为p38α（p38）、p38β1、p38β2、p38γ、p38δ。其分布具有组织特异性，p38α、p38β1、p38β2在各种组织细胞中广泛存在，p38γ仅在骨骼肌细胞中存在，而p388主要存在于腺体组织中。研究表明，p38蛋白激酶的激活影响细胞生长、周期和凋亡等，并参与炎症、应激反应的调控。另外，许多MKK激酶可以激活p38蛋白激酶信号通路，这些激酶包括 MTK1、MLK2/MST、DLK/MUK/ZPK、ASK1/MAPKK5、MAP3K和TAK1。其中MAP3K是MAPK级联反应的主要成分，其过表达可以激活p38与JNK信号通路。基于激酶催化结构域的序列，MAP3K被分为三组：MEKK样、ZIK样和Raf样家族。Raf样MAP3K构成最大的MAP3K亚家族。MAP3K通过丝氨酸和（或）苏氨酸的磷酸化激活MAP2K，并且MAP2K通过Thr-X-Tyr基序的双磷酸化激活MAPK。近年来研究发现，MAPKAP-K3（M3）是p38的底物，其属于丝氨酸蛋白激酶，激活后的M3可磷酸化其他不同的底物，包括热休克蛋白27（HSP27）、淋巴细胞特异性蛋白1、ATF1和酪氨酸羟化酶等。p38的其他底物包括蛋白激酶MNK1、PRAK、丝裂酶原和应激激活激酶MSK。JNK与p38均可磷酸化转录因子，包括转录因子1-2（ATF1-2）、Elk-1等，另外，p38还可作用于转录因子CHOP10、GADD153、C/EBP和p53等。而这些底物中ATF1和ATF2均可结合环磷酸腺苷，形成同源二聚体。它们亦可与c-Jun结合形成异源二聚体，进而调控信号通路分子的表达。有研究发现，caspase抑制剂与Fas发生相互作用，进而抑制p38的活性，从而起到调控细胞凋亡的作用。研究发现，MKK6b过表达激活caspase，导致肿瘤细胞发生凋亡。综上所述，p38信号通路通过调控caspase上游与下游信号蛋白来调控细胞凋亡。但是，p38信号通路在细胞凋亡过程中如何调控caspase，具体机制仍有待进一步研究。

（三）错配修复途径

DNA错配修复基因（DNA mismatch repair gene）首先在细菌和酵母中发现，在人类基因组中也存在类似物。DNA错配修复基因既非原癌基因，也非抑癌基因，是另一类肿瘤相关基因。错配修复基因（MMR基因）是一类与人类的错配修复反应有关的基因，包括hMSH2、hMLH1、hMSH3、hMSH6、hPMSH1和hPMSH2等基因。MMR基因最早是在遗传性非息肉性大肠癌中分离得到的一组遗传易感基因，该系统任一基因发生突变都会导致细胞错配修复功能缺陷，进而导致遗传不稳定，表现为复制错误或微卫星不稳定性，因而容易发生肿瘤。1993年，Aaltonen等学者研究发现，在12％～15％的CRC患者中存在微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI），他们提出了错配修复途径。该途径的基本原理是MMR基因保证了DNA复制的高度保真，如果MMR基因发生突变或启动子甲基化，引起MMR基因失活，将会导致机体错配修复功能降低，整个基因组不稳定。MMR基因功能缺陷表现型是高度的微卫星不稳定性（MSI），又称为复制错误（replication error，RER），从而使某些原癌基因和抑癌基因发生突变，并在体内快速聚集，导致肿瘤发生，在此途径中，hMLH1和hMSH2这两个MMR基因起主要作用。hMLH1的cDNA全长为2484 hp，具有编码长度为2268bp的开放阅读框。hMLH1蛋白由756个氨基酸残基组成。hMLH1蛋白的表达变化可以很好地预示MMR基因功能缺陷的存在，在结直肠癌细胞中发挥重要的调控作用。

在DNA错配修复中，hMSH2与hMSH6形成一种称为hMutSα的二聚体复合物，并结合到DNA碱基错配区，而hMLH1与hPSH2发生相互作用并形成二聚体hMutLα，该二聚体发挥识别新生DNA链的作用。hMutLα结合到DNA错配区后，可激活与MutH蛋白有关的GATC核酸内切酶，并切除未修饰的甲基化GATC序列。依赖于MutS、MutL及DNA解旋酶的协同作用，随着新生链错配区的切除，整个修复反应立即被启动。

UC相关性结直肠癌MMR基因的突变导致MMR基因功能缺陷，引起细胞基因发生突变和DNA复制错误，导致某些抑癌基因突变率增高，如积累到一定程度可导致肿瘤的发生。有研究发现，hMSH2蛋白阳性表达率从正常组织到结直肠癌组织逐渐降低，MMR基因的突变发生率随恶性程度的增加而增高，提示MMR基因的突变，尤其是hMSH2的突变可能是结直肠癌发生的早期事件之一。遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）是一种特殊类型的结直肠癌，是由于MMR基因发生突变所致的一种单基因显性遗传性疾病，又称林奇综合征，占结直肠癌的15％～18％。结直肠腺瘤在HNPCC中较易发生，而HNPCC相关腺瘤与其他腺瘤有明显不同，可以是单发，也可以是多发，组织学上多为绒毛状腺瘤，常表现为明显的异型性，可迅速由腺瘤发展为腺癌，大部分HNPCC相关腺瘤存在基因不稳定性。Russell等发现错配修复缺陷造成的微卫星DNA重复序列数不稳定与HNPCC由腺瘤向腺癌转变有关。腺瘤阶段，微卫星DNA重复序列数发生改变的比例明显低于腺癌阶段。这说明大多数HNPCC在良性的腺瘤阶段已有部分基因向不稳定发展，微卫星DNA重复序列数改变速率越快，腺瘤恶变的可能性就越大。

核苷酸错配有以下三种情况：①DNA的物理损伤；②DNA复制过程中核苷酸的错误掺入；③基因重组。DNA聚合酶能催化不能与模板形成氢键的错误碱基，这种复制错误通常由聚合酶立即纠正，再开始下一个核苷酸的聚合反应。在某些特殊条件下，DNA聚合酶将极少的错误碱基遗留在DNA链上而未予以纠正，因此，DNA错配修复必须要有错配修复系统（MMRS）参与，其在修复过程中具有高度特异性，并较为准确地识别错配碱基。错配修复反应既可修复DNA复制过程中出现的碱基错配，又可消除由于含简单重复序列的同源序列间遗传重组出现的不配对序列，这样可有效地防止DNA复制差错的产生。错配修复缺陷细胞容易对顺铂产生耐药性，但对奥沙利铂不产生耐药性，表明错配修复缺陷细胞能够耐受顺铂-DNA复合物及错配修复涉及的旁路复制。通过体外研究发现，噬菌体T7和T4 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、大肠杆菌聚合酶Ⅰ及大肠杆菌聚合酶Ⅲ能够以不同的方式调控顺铂旁路复制途径的活性。研究发现，人聚合酶β、γ、η（XP-Ⅴ基因的产物），Rev3/Rev7络合物和人类免疫缺陷病毒Ⅰ型逆转录酶亦可以调控顺铂旁路复制途径的活性。

目前临床上将hMSH2、hMLH1两种基因的检测作为MMR基因突变分析的初筛指标。由于结直肠癌的发生与MMR基因关系密切，且MMR基因异常者患结直肠癌的风险明显增高。因此，对有结直肠癌家族史的人群应进行MMR基因检测，以确定其患结直肠癌的风险，从而采取相应的措施，以实现早发现、早治疗。虽然目前对hMSH2等MMR基因缺陷与结直肠癌的相关性进行了深入的研究，但仍有很多问题需要解决，如MMR基因与原癌基因和抑癌基因之间的相互关系；MMR基因缺陷影响细胞凋亡的信号转导机制等。错配修复的缺陷和复制旁路的强化是肿瘤细胞对顺铂耐药的主要机制；与顺铂不同的是，MMRS缺陷和复制旁路强化不会影响奥沙利铂的细胞毒性。

四、丝裂原活化蛋白激酶

顺铂在调控丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路中发挥重要作用。该激酶是一组能被不同的细胞外刺激因子如细胞因子、神经递质、激素等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。最初MAPK是培养细胞在受到生长因子等丝裂原刺激时被激活而被发现的。MAPK信号通路具有三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK，这三种激酶按照先后顺序被激活，共同调控细胞的生长、分化、对环境的应激适应及炎症反应等过程。MAPK在基因表达调控和细胞功能活动中发挥关键作用。MAPK链（MAP3K-MAP2K-MAPK）由3类蛋白激酶组成，通过依次磷酸化将上游信号传递至下游应答分子。MAPK可分为4个亚族：ERK、p38、JNK和ERK5。其活性由活化环的氨基酸序列中的双磷酸化位点所调控。MAPK活化环中的TXY序列是特定的MKK催化进行双磷酸化反应的位点。与MAPK磷酸化位点不同的是，ERK/ERK2双磷酸化位点是Thr183和Tyr185。

MAPK信号通常涉及多层信号通路，MAPK和MAP2K的激活机制相对简单，而MAP3K的激活机制相对复杂许多，如c-Raf、MEKK4或MLK3需要多个步骤来激活，这些酶通常是受变构效应控制的酶，通过多种机制紧密地锁定在非活性状态。激活第一步是在细胞膜上通过较小的配体来减轻它们的自抑制，一旦MAP3K完全激活，它可以磷酸化其底物MAP2K，这反过来又让MAP2K磷酸化它们的底物MAPK。MAPK级联激活是接收膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的过程。在未受刺激的细胞内，MAPK处于静止状态。细胞受到生长因子刺激后，MAPK接收MKK和MKKK的活化信号而被激活，逐级磷酸化。JNK是细胞应对各种应激原诱导的信号转导的关键分子，参与细胞对辐射、渗透压、温度变化等的应激反应。p38介导炎症反应、细胞凋亡等，因而成为研发抗炎药物的靶位。

MAPK可磷酸化与脯氨酸相邻的丝氨酸/苏氨酸，并且通过这种方式激活其他蛋白激酶、核蛋白和转录因子。MAPK接受磷酸化级联反应的调节，识别抑制性或激活性输入信号。MAPK信号转导过程中存在两个主要特点，一个是对信号的放大作用；另一个是MEK对MAPK的双磷酸化作用。近年来许多研究发现，JNK在肿瘤的发生与发展中发挥重要作用。JNK又被称为应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK），是哺乳动物细胞中MAPK信号通路的另一亚类。JNK由3个基因编码，JNK1和JNK2基因在全身广泛表达，而JNK3基因仅见于脑、心脏和睾丸。在未受刺激的细胞中，JNK主要存在于细胞质内，但在细胞核内也有一定分布。在受到刺激后，其迅速聚积于细胞核内，并导致相应基因表达发生改变。JNK基因通过选择性剪接而产生10种JNK形式，JNK基因编码的蛋白质有或无羧基末端，结果产生分子质量为46 kD或54kD的两种蛋白质。不同组织通过选择性剪接来调控JNK与底物的结合能力，从而决定作用底物的特异性。干扰DNA、细胞因子、蛋白质合成药物、外源性应激原、生长因子及转化因子等均可激活JNK。其中JNK1属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包含11个蛋白激酶亚结构域，这些基因序列包含了该蛋白激酶的保守特征，即含有ATP与底物结合的位点，并保持蛋白激酶的立体结构。研究发现JNK1和JNK2的底物特异性在功能上有所不同，比如，c-Jun先与JNK1结合并被其磷酸化，而ATF2则与JNK2发生结合。MAP2K通过磷酸化酪氨酸及苏氨酸激活JNK，但是JNK通过发生双磷酸化而激活的具体机制目前仍然不是很清楚，其可能机制是双磷酸化改变了T环本身的结构及氨基末端的序列，并产生了一个活化位点。

JNK3是JNK家族成员，能够磷酸化细胞核内的c-Jun、JunB、JunD、ATF-2和Elk-1等转录因子，其亦能磷酸化细胞质内的Bcl-2家族蛋白、tau蛋白和SCG10等蛋白。有研究显示，JNK3基因包含13个内含子和14个外显子，其转录起始位点在外显子3内，而终止密码子在外显子14内。另外，放射杂交图谱分析和荧光原位杂交技术分析显示，JNK3基因定位在4q21-22，选择性在脑细胞中表达。生长因子、细胞因子和外源性应激信号均可激活JNK，目前发现JNK上游激酶包括MKK4及MKK7。MKK4和MKK7除了磷酸化JNK外，还磷酸化p38。有研究发现，MKK4更倾向于磷酸化JNK中的酪氨酸残基，而MKK7则倾向于磷酸化JNK中的苏氨酸残基。正是由于以上差异性，激酶可以共同激活JNK，从而有利于信号进一步整合。

JNK对底物具有双重识别机制。它识别底物的Ser/Thr-X-Pro模序并将其磷酸化，c-Jun分子锚定模序的存在加强了其与JNK的结合，有效地提高了JNK的局部浓度，并指导着JNK对N端的磷酸化。JNK的底物均为核内的转录因子，如c-Jun、ATF-2、Elk-1、p53、DPC4和NF-AT4。JNK磷酸化c-Jun的Ser63和Ser73，促使Jun/Jun同源二聚体和Jun/ATF2异源二聚体的形成，提高了c-Jun抗泛肽降解的能力。因此，JNK不仅可以激活转录因子，而且可以提高它们的稳定性，从而促进目的基因表达。但JNK磷酸化转录因子NF-AT4持续激活，阻止其进入细胞核内发挥作用。有研究发现，如受到某些应激原的刺激，Rho家族通过受体酪氨酸激酶介导JNK的激活。Rho家族蛋白是Ras超家族中的蛋白质，是一组分子量为20000～25000的三磷酸鸟苷结合蛋白，具有GTP酶活性，因此也被称为Rho GTP酶。该酶家族大约包含20个成员，根据结构和功能不同分为5个亚家族：①Rho亚家族，包括RhoA、RhoB和RhoC，它们在序列上具有高度同源性；②Rac亚家族，包括Rac1、Rac2、Rac3和RhoG；③Cdc42亚家族，包括Cdc42、TC10、TCL、Wrch1和chp/Wrch2；④Rnd亚家族，包括Rnd1、Rnd3/RhoE和Rnd2；⑤Rho BTB亚家族，包括Rho BTB1和Rho BTB2。近年来研究发现，Rho GTP酶在多种恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。肿瘤细胞在基质中的运动通常由4个循环往复的步骤组成：①头部伪足的形成和延伸；②新黏附位点的建立；③胞体的收缩；④尾部的退缩。肿瘤细胞通过这四个步骤不断向前迁移。针对这一过程调控的分子机制涉及多条信号通路。在多条信号级联反应通路中，RhoA、Rac1和Cdc42发挥调控肿瘤细胞侵袭、转移过程的作用。

肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF）家族是一类胞内接头蛋白，其能介导TNF受体和Toll样/IL-1受体与多种信号通路下游信号蛋白质（包括NF-κB和JNK）的信号转导。TRAF参与调控细胞增殖、分化及凋亡等生理过程。由于在信号通路中的关键作用，TRAF功能失常与多种疾病的发生密切相关。TRAF介导细胞因子受体活化JNK，如TNF活化过程需要募集TRAF2，而TRAF2分子可与MEKK1、ASK1相结合。TRAF6募集IL-1受体并激活JNK，TRAF6亦可以与MEKK1、TAK1相结合。TNF分为1型与2型，其中1型也称为p55或者p60；2型称为p75或者p80，两者的区别在于细胞内结构域不同：1型具有“死亡结构域”，而2型则不具备此结构域。但是，TNF 1型与2型均可以直接或者间接募集TRAF2进而激活JNK，但TRAF2激活JNK信号通路下游信号分子的具体机制仍然有待进一步研究。在无TNF参与的前提下，如果TRAF2过表达也可激活JNK和p38。蛋白质-蛋白质相互作用是目前公认的JNK信号通路的关键机制，蛋白质复合体的形成影响信号转导的特异性，这些复合体参与激酶之间的相互作用或者蛋白质与激酶间的相互作用。最近，人们发现JNK信号通路的负反馈调节因子包括热休克蛋白72、原癌基因Evil和原癌基因MKP7。其中原癌基因MKP7选择性灭活JNK和p38的某些同源异构体；热休克蛋白72抑制JNK，进而调节JNK的活性并导致细胞发生凋亡；原癌基因Evil通过抑制JNK进而抑制应激原，促使细胞凋亡的发生。JNK与p38均在细胞凋亡过程中发挥重要的作用，JNK信号通路的异常活化与人体肿瘤的发生和发展关系密切，因此JNK信号通路是干预治疗的一个潜在的靶向位点。对JNK信号通路的研究存在一个非常关键的问题，即JNK具有依赖不同信号翻译的能力，这可能是由于JNK与细胞内存在的其他信号通路之间存在相互作用。

有研究发现，在顺铂杀伤肿瘤细胞的过程中所有激酶均被激活。顺铂通过调控p53的Ser15磷酸化来调控ERK的活性。此外，有学者发现MEK-ERK信号通路参与顺铂耐药性的产生。有研究发现，顺铂通过激活MAPK级联反应来调控细胞凋亡的发生，而该级联反应中存在一定的差异性，这可能是由MAPK家族处于不同背景下时对细胞或DNA损伤的反应程度不同造成的。HMG1蛋白和HMG2蛋白促进p53与DNA发生结合，使HMG蛋白能够与p53之间建立直接的联系。顺铂导致p53活性增加，进而导致一些基因活性的改变，包括p21WAF1/CIP1基因、Gadd45a基因及Bax基因活性改变，引起细胞周期阻滞、DNA修复及细胞凋亡。有报道证实，MDM2调控p53蛋白的活性。Gadd45a蛋白与增殖细胞核抗原（PCNA）之间关系紧密，其可以增强NER的活性，并保护细胞免受顺铂的细胞毒作用。然而，当DNA损伤超过临界值，即超过细胞本身的修复能力时，细胞发生凋亡。这种程序式的细胞死亡是一种复杂的、精细的过程。具体来讲，在细胞凋亡发生过程中，促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比例决定其是否发生凋亡。顺铂可诱导Bcl-2发生裂解来增加Bax/Bcl-2比例，进而激活凋亡级联反应发生，诱导细胞发生凋亡。另外，顺铂会通过介导Fas/Fas配体相关的caspase8-caspase3来调控p53，然而这条途径具体的机制仍有待进一步研究。

对于p53如何诱导顺铂作用于肿瘤细胞使其发生凋亡目前仍然没有统一的认识。但是，Fan等通过实验发现，p53功能破坏可以增加肿瘤细胞对铂类药物的敏感性，并降低耐药性的发生，这与目前大多数学者的观点是相反的。值得注意的是，这种发现可能与肿瘤细胞中出现的细胞凋亡功能障碍有关，对如何克服化疗药物耐药性是非常有价值的。对于消除p53的功能后肿瘤细胞对化疗药物敏感性增加的具体机制依然有待进一步研究，但顺铂可能通过下调p53依赖的p21WAF1/CIP1基因介导的方式来调控细胞周期进而增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性。究其原因是在这种情况下p21WAF1/CIP1失去作用而导致G2/M期发生阻滞，从而使肿瘤细胞过早进入有丝分裂，导致细胞发生死亡。研究者通过敲低G2/M期关键点发现肿瘤细胞发生凋亡，进一步证明这种机制的可行性，该过程不涉及p53基因的活性。p53基因是生物体内存在的一种抑制细胞转变为肿瘤细胞的基因。细胞中本来就有原癌基因及抑癌基因的存在，只要一方产生病变而失去平衡，癌症就可能发生。人类p53基因定位于17号染色体p13，全长16～20 kb，其含11个外显子，编码蛋白质为p53，是一种核内磷酸化蛋白。p53基因是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。p53基因是一种肿瘤抑制基因，在所有恶性肿瘤中，50％以上的患者会出现该基因的突变。该基因编码的p53蛋白是一种转录因子，调控细胞周期的启动。如果细胞受损，又不能得到修复，p53蛋白将启动促凋亡程序，促使该细胞发生凋亡。p53蛋白也是一种核磷酸化蛋白，由393个氨基酸组成，在体内以四聚体的形式存在，半衰期为20～30 min。p53蛋白包含4个主要功能域，其参与调控细胞周期、DNA修复和细胞凋亡等过程。p53蛋白是一种对基因毒素类药物有效的介质，并通过转录调控发挥作用。应用基因毒素类药物后，p53蛋白通过一些后转录机制导致其含量增加。有趣的是，突变型细胞中p53蛋白对顺铂更容易产生耐药性。DNA的特异性序列与p53蛋白发生结合是p53蛋白发挥抑制肿瘤生长作用的关键机制，人类基因组中活化的p53蛋白与大约100种不同的信号分子发生结合。通过研究顺铂修饰DNA与野生型人p53蛋白的相互作用发现，p53蛋白可以与顺铂-DNA复合物结合，亦可与反铂-DNA复合物发生作用。

五、“非经典”的抗肿瘤铂类化合物

目前临床中没有通过临床试验证明治疗效果优于顺铂且与顺铂结构类似的化疗药物。因此，探索与持续改进铂类抗肿瘤药物，研发出毒性较低的化合物，并且不与顺铂或其类似物发生交叉耐药是目前研究的热点。有研究发现，如果顺铂以另外一种方式与DNA发生结合，其现有的结构与原来的结构无直接联系，将导致顺铂的药理特性发生改变，根据这个概念已经研发出一些新的铂类抗肿瘤化合物。有研究进一步发现，在肿瘤细胞中使用这些新的铂类药物后，DNA修饰后形成不同的DNA复合物，其产生的化疗效果亦明显不同。因此，了解新的铂类抗肿瘤药物的DNA复合物修复过程，可为新的抗癌药物和新的化疗策略的设计提供思路。

BBR3464是一种新型铂类药物，与顺铂无交叉耐药性，其为+4价高电荷铂类药物，与两端的铂相连的两个Cl配体间的距离较短，从而使该药物与DNA交联的速度比其他药物快，形成1，4-链间交联。研究显示，BBR3464与DNA的识别能力强，结合稳定，它们所形成的复合物中既有Pt-N7间较强的配位键，亦有氢键和弱氢键。复合物中的结合位点及结合位点外的嘌呤碱基的结构发生了不同程度的改变，DNA在嵌合进药物中后，其构型并未发生特定的弯曲，通过嘌呤碱基的构象转化，对DNA造成的损伤与经典的铂类药物不同。因此，BBR3464比顺铂更有效，并且能够克服顺铂的耐药性。BBR3464之所以有更好的治疗效果，要归功于DNA复合物形成增加。在等剂量下，BBR3464导致的细胞凋亡程度高于顺铂，并且能降低耐药性的产生。细胞周期研究分析显示，BBR3464具有剂量依赖性G2/M阻滞作用，顺铂导致p53、p21和Bax表达水平上调，而BBR3464治疗后仅观察到p21诱导。在对顺铂耐药的细胞中，细胞对顺铂敏感性的降低与顺铂诱导p53/p21通路的耐药性平行，而相同剂量的BBR3464在耐药细胞中诱导p21的程度较低。临床研究发现，在顺铂耐药细胞中使用BBR3464后，其杀伤肿瘤细胞的效果比顺铂要好。在p53突变型人类肿瘤异位种植动物模型中发现，BBR3464亦可以发挥较强的抗肿瘤效果。对于这个重要的发现，如果在60％以上p53突变肿瘤患者中应用此新的化疗药物，其治疗效果一定会有较大程度的提高。化疗药物导致DNA损伤，通过p53信号通路介导一些生物学变化，因此，对于已经发生p53突变的肿瘤细胞，最佳的方法是绕过此信号通路。具有双向功能的三核BBR3464作为第一个多核的铂类化合物在临床上使用，最引人关注的是BBR3464的特异性DNA结合模式，它能迅速形成较大范围的非局域性结构，形成链内或链间连接。三核BBR3464与顺铂相比具有许多不同之处。

BBR3464如何影响高速泳动族B1（high mobility group B1，HMGB1）蛋白的功能是目前研究的热点问题。HMGB1是一种高度保守的核蛋白，1973年首次在牛胸腺中被提取和鉴定，其因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移能力而得名。核蛋白是结合蛋白质中的一类，是存在于生物的细胞核中具有特殊形态的蛋白质，由核酸与组蛋白、精蛋白等碱性蛋白质结合而成为细胞核的主要成分。根据核酸种类不同，核蛋白可分为核糖核酸核蛋白和脱氧核糖核酸核蛋白。HMG根据分子量大小、序列相似性和DNA结构特性等特征，可分为HMGA、HMGB和HMGN 3个家族。而HMGB家族又有3个成员，即HMGB1、HMGB2和HMGB3，三者在氨基酸序列上具有较高的同源性。其中HMGB1含量最为丰富，广泛分布于淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾和肾等组织或器官中，其除在肝和脑中主要存在于细胞质外，在其他组织或器官中仅存在于细胞核内。细胞核中HMGB1的主要功能是与DNA发生结合。HMGB1被特异性结合蛋白募集至靶点时，通过与DNA双链小槽的结合，促使双链局部变形，导致DNA形成三维结构。细胞核内HMGB1与特定结构超螺旋DNA结合，影响靶序列的结构，参与DNA的重组、修复、基因转录调控、细胞复制及分化成熟等活动。HMGB1参与肿瘤细胞的增殖、分化和迁移，有研究还发现在结肠癌组织中，HMGB1 mRNA表达水平比其在相邻正常组织中的表达水平要高。胞外的HMGB1促进细胞发生迁移，这一点在肿瘤细胞的入侵和转移过程中尤为重要。HMGB1具有黏性，它可以与细胞表面多种不同分子如肝素、蛋白聚糖、硫糖脂和磷脂等结合。随着对HMGB1细胞生物学功能研究的不断深入，人们发现HMGB1在肿瘤等疾病中发挥着重要作用，HMGB1可能成为新的治疗靶点。BBR3464链内连接可以增强药物的敏感性，但这不与其杀伤肿瘤的效果有直接相关性，因其链内连接不能持续增强化疗药物的抗癌作用。

六、结论

目前接头蛋白研究已成为一个热点，接头蛋白具有特殊结构域或者特异性的氨基酸残基，在细胞信号转导过程中作为调节因子发挥重要的调控和衔接作用，是细胞信号转导过程中非常重要的信号蛋白。目前研究发现，如果接头蛋白发生突变或者其功能发生改变，则会影响细胞生长。如果以信号作为靶向目标寻找新的化疗药物，则在解决化疗药物耐药性问题时可以选择肿瘤的特异性接头蛋白作为靶向分子进行筛选。铂类化疗药物对肿瘤细胞发挥毒性效应时有较多的缺点，因此目前研究的热点是探讨分子机制及生物活性以改进铂类药物。肿瘤细胞对顺铂产生耐药性的机制仍有待进一步研究。事实上，研究化疗药物促使肿瘤细胞发生凋亡、衰老和有丝分裂等的具体机制，有助于对耐药性机制进行研究。尽管如此，铂类化疗药物化学结构的改变会大幅改变其DNA结合模式，导致DNA的损伤以及耐药性的产生。因此，必须进一步了解顺铂和新的铂类化疗药物如何修饰DNA以及通过差异蛋白识别和修复来促使下游信号通路中的信号分子调控细胞生物学功能，这些过程会导致耐药性产生。此外，对于DNA之间的相互作用，需要在细胞水平了解其具体作用机制，也需要更多的研究进一步验证。至今在耐药性方面进行的研究涉及多个系统，包括DNA修复、复制、转录及细胞周期和细胞凋亡等过程。了解顺铂等化疗药物如何修饰DNA并影响其下游信号通路中的信号分子，有助于研究这些药物的耐药性机制。

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