丝裂原活化蛋白激酶

顺铂在调控丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路中发挥重要作用。该激酶是一组能被不同的细胞外刺激因子如细胞因子、神经递质、激素等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。最初MAPK是培养细胞在受到生长因子等丝裂原刺激时被激活而被发现的。MAPK信号通路具有三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK，这三种激酶按照先后顺序被激活，共同调控细胞的生长、分化、对环境的应激适应及炎症反应等过程。MAPK在基因表达调控和细胞功能活动中发挥关键作用。MAPK链（MAP3K-MAP2K-MAPK）由3类蛋白激酶组成，通过依次磷酸化将上游信号传递至下游应答分子。MAPK可分为4个亚族：ERK、p38、JNK和ERK5。其活性由活化环的氨基酸序列中的双磷酸化位点所调控。MAPK活化环中的TXY序列是特定的MKK催化进行双磷酸化反应的位点。与MAPK磷酸化位点不同的是，ERK/ERK2双磷酸化位点是Thr183和Tyr185。

MAPK信号通常涉及多层信号通路，MAPK和MAP2K的激活机制相对简单，而MAP3K的激活机制相对复杂许多，如c-Raf、MEKK4或MLK3需要多个步骤来激活，这些酶通常是受变构效应控制的酶，通过多种机制紧密地锁定在非活性状态。激活第一步是在细胞膜上通过较小的配体来减轻它们的自抑制，一旦MAP3K完全激活，它可以磷酸化其底物MAP2K，这反过来又让MAP2K磷酸化它们的底物MAPK。MAPK级联激活是接收膜受体转换与传递的信号并将其带入细胞核内的过程。在未受刺激的细胞内，MAPK处于静止状态。细胞受到生长因子刺激后，MAPK接收MKK和MKKK的活化信号而被激活，逐级磷酸化。JNK是细胞应对各种应激原诱导的信号转导的关键分子，参与细胞对辐射、渗透压、温度变化等的应激反应。p38介导炎症反应、细胞凋亡等，因而成为研发抗炎药物的靶位。

MAPK可磷酸化与脯氨酸相邻的丝氨酸/苏氨酸，并且通过这种方式激活其他蛋白激酶、核蛋白和转录因子。MAPK接受磷酸化级联反应的调节，识别抑制性或激活性输入信号。MAPK信号转导过程中存在两个主要特点，一个是对信号的放大作用；另一个是MEK对MAPK的双磷酸化作用。近年来许多研究发现，JNK在肿瘤的发生与发展中发挥重要作用。JNK又被称为应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK），是哺乳动物细胞中MAPK信号通路的另一亚类。JNK由3个基因编码，JNK1和JNK2基因在全身广泛表达，而JNK3基因仅见于脑、心脏和睾丸。在未受刺激的细胞中，JNK主要存在于细胞质内，但在细胞核内也有一定分布。在受到刺激后，其迅速聚积于细胞核内，并导致相应基因表达发生改变。JNK基因通过选择性剪接而产生10种JNK形式，JNK基因编码的蛋白质有或无羧基末端，结果产生分子质量为46 kD或54kD的两种蛋白质。不同组织通过选择性剪接来调控JNK与底物的结合能力，从而决定作用底物的特异性。干扰DNA、细胞因子、蛋白质合成药物、外源性应激原、生长因子及转化因子等均可激活JNK。其中JNK1属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包含11个蛋白激酶亚结构域，这些基因序列包含了该蛋白激酶的保守特征，即含有ATP与底物结合的位点，并保持蛋白激酶的立体结构。研究发现JNK1和JNK2的底物特异性在功能上有所不同，比如，c-Jun先与JNK1结合并被其磷酸化，而ATF2则与JNK2发生结合。MAP2K通过磷酸化酪氨酸及苏氨酸激活JNK，但是JNK通过发生双磷酸化而激活的具体机制目前仍然不是很清楚，其可能机制是双磷酸化改变了T环本身的结构及氨基末端的序列，并产生了一个活化位点。

JNK3是JNK家族成员，能够磷酸化细胞核内的c-Jun、JunB、JunD、ATF-2和Elk-1等转录因子，其亦能磷酸化细胞质内的Bcl-2家族蛋白、tau蛋白和SCG10等蛋白。有研究显示，JNK3基因包含13个内含子和14个外显子，其转录起始位点在外显子3内，而终止密码子在外显子14内。另外，放射杂交图谱分析和荧光原位杂交技术分析显示，JNK3基因定位在4q21-22，选择性在脑细胞中表达。生长因子、细胞因子和外源性应激信号均可激活JNK，目前发现JNK上游激酶包括MKK4及MKK7。MKK4和MKK7除了磷酸化JNK外，还磷酸化p38。有研究发现，MKK4更倾向于磷酸化JNK中的酪氨酸残基，而MKK7则倾向于磷酸化JNK中的苏氨酸残基。正是由于以上差异性，激酶可以共同激活JNK，从而有利于信号进一步整合。

JNK对底物具有双重识别机制。它识别底物的Ser/Thr-X-Pro模序并将其磷酸化，c-Jun分子锚定模序的存在加强了其与JNK的结合，有效地提高了JNK的局部浓度，并指导着JNK对N端的磷酸化。JNK的底物均为核内的转录因子，如c-Jun、ATF-2、Elk-1、p53、DPC4和NF-AT4。JNK磷酸化c-Jun的Ser63和Ser73，促使Jun/Jun同源二聚体和Jun/ATF2异源二聚体的形成，提高了c-Jun抗泛肽降解的能力。因此，JNK不仅可以激活转录因子，而且可以提高它们的稳定性，从而促进目的基因表达。但JNK磷酸化转录因子NF-AT4持续激活，阻止其进入细胞核内发挥作用。有研究发现，如受到某些应激原的刺激，Rho家族通过受体酪氨酸激酶介导JNK的激活。Rho家族蛋白是Ras超家族中的蛋白质，是一组分子量为20000～25000的三磷酸鸟苷结合蛋白，具有GTP酶活性，因此也被称为Rho GTP酶。该酶家族大约包含20个成员，根据结构和功能不同分为5个亚家族：①Rho亚家族，包括RhoA、RhoB和RhoC，它们在序列上具有高度同源性；②Rac亚家族，包括Rac1、Rac2、Rac3和RhoG；③Cdc42亚家族，包括Cdc42、TC10、TCL、Wrch1和chp/Wrch2；④Rnd亚家族，包括Rnd1、Rnd3/RhoE和Rnd2；⑤Rho BTB亚家族，包括Rho BTB1和Rho BTB2。近年来研究发现，Rho GTP酶在多种恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。肿瘤细胞在基质中的运动通常由4个循环往复的步骤组成：①头部伪足的形成和延伸；②新黏附位点的建立；③胞体的收缩；④尾部的退缩。肿瘤细胞通过这四个步骤不断向前迁移。针对这一过程调控的分子机制涉及多条信号通路。在多条信号级联反应通路中，RhoA、Rac1和Cdc42发挥调控肿瘤细胞侵袭、转移过程的作用。(https://www.daowen.com)

肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF）家族是一类胞内接头蛋白，其能介导TNF受体和Toll样/IL-1受体与多种信号通路下游信号蛋白质（包括NF-κB和JNK）的信号转导。TRAF参与调控细胞增殖、分化及凋亡等生理过程。由于在信号通路中的关键作用，TRAF功能失常与多种疾病的发生密切相关。TRAF介导细胞因子受体活化JNK，如TNF活化过程需要募集TRAF2，而TRAF2分子可与MEKK1、ASK1相结合。TRAF6募集IL-1受体并激活JNK，TRAF6亦可以与MEKK1、TAK1相结合。TNF分为1型与2型，其中1型也称为p55或者p60；2型称为p75或者p80，两者的区别在于细胞内结构域不同：1型具有“死亡结构域”，而2型则不具备此结构域。但是，TNF 1型与2型均可以直接或者间接募集TRAF2进而激活JNK，但TRAF2激活JNK信号通路下游信号分子的具体机制仍然有待进一步研究。在无TNF参与的前提下，如果TRAF2过表达也可激活JNK和p38。蛋白质-蛋白质相互作用是目前公认的JNK信号通路的关键机制，蛋白质复合体的形成影响信号转导的特异性，这些复合体参与激酶之间的相互作用或者蛋白质与激酶间的相互作用。最近，人们发现JNK信号通路的负反馈调节因子包括热休克蛋白72、原癌基因Evil和原癌基因MKP7。其中原癌基因MKP7选择性灭活JNK和p38的某些同源异构体；热休克蛋白72抑制JNK，进而调节JNK的活性并导致细胞发生凋亡；原癌基因Evil通过抑制JNK进而抑制应激原，促使细胞凋亡的发生。JNK与p38均在细胞凋亡过程中发挥重要的作用，JNK信号通路的异常活化与人体肿瘤的发生和发展关系密切，因此JNK信号通路是干预治疗的一个潜在的靶向位点。对JNK信号通路的研究存在一个非常关键的问题，即JNK具有依赖不同信号翻译的能力，这可能是由于JNK与细胞内存在的其他信号通路之间存在相互作用。

有研究发现，在顺铂杀伤肿瘤细胞的过程中所有激酶均被激活。顺铂通过调控p53的Ser15磷酸化来调控ERK的活性。此外，有学者发现MEK-ERK信号通路参与顺铂耐药性的产生。有研究发现，顺铂通过激活MAPK级联反应来调控细胞凋亡的发生，而该级联反应中存在一定的差异性，这可能是由MAPK家族处于不同背景下时对细胞或DNA损伤的反应程度不同造成的。HMG1蛋白和HMG2蛋白促进p53与DNA发生结合，使HMG蛋白能够与p53之间建立直接的联系。顺铂导致p53活性增加，进而导致一些基因活性的改变，包括p21WAF1/CIP1基因、Gadd45a基因及Bax基因活性改变，引起细胞周期阻滞、DNA修复及细胞凋亡。有报道证实，MDM2调控p53蛋白的活性。Gadd45a蛋白与增殖细胞核抗原（PCNA）之间关系紧密，其可以增强NER的活性，并保护细胞免受顺铂的细胞毒作用。然而，当DNA损伤超过临界值，即超过细胞本身的修复能力时，细胞发生凋亡。这种程序式的细胞死亡是一种复杂的、精细的过程。具体来讲，在细胞凋亡发生过程中，促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比例决定其是否发生凋亡。顺铂可诱导Bcl-2发生裂解来增加Bax/Bcl-2比例，进而激活凋亡级联反应发生，诱导细胞发生凋亡。另外，顺铂会通过介导Fas/Fas配体相关的caspase8-caspase3来调控p53，然而这条途径具体的机制仍有待进一步研究。

对于p53如何诱导顺铂作用于肿瘤细胞使其发生凋亡目前仍然没有统一的认识。但是，Fan等通过实验发现，p53功能破坏可以增加肿瘤细胞对铂类药物的敏感性，并降低耐药性的发生，这与目前大多数学者的观点是相反的。值得注意的是，这种发现可能与肿瘤细胞中出现的细胞凋亡功能障碍有关，对如何克服化疗药物耐药性是非常有价值的。对于消除p53的功能后肿瘤细胞对化疗药物敏感性增加的具体机制依然有待进一步研究，但顺铂可能通过下调p53依赖的p21WAF1/CIP1基因介导的方式来调控细胞周期进而增强肿瘤细胞对顺铂的敏感性。究其原因是在这种情况下p21WAF1/CIP1失去作用而导致G2/M期发生阻滞，从而使肿瘤细胞过早进入有丝分裂，导致细胞发生死亡。研究者通过敲低G2/M期关键点发现肿瘤细胞发生凋亡，进一步证明这种机制的可行性，该过程不涉及p53基因的活性。p53基因是生物体内存在的一种抑制细胞转变为肿瘤细胞的基因。细胞中本来就有原癌基因及抑癌基因的存在，只要一方产生病变而失去平衡，癌症就可能发生。人类p53基因定位于17号染色体p13，全长16～20 kb，其含11个外显子，编码蛋白质为p53，是一种核内磷酸化蛋白。p53基因是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。p53基因是一种肿瘤抑制基因，在所有恶性肿瘤中，50％以上的患者会出现该基因的突变。该基因编码的p53蛋白是一种转录因子，调控细胞周期的启动。如果细胞受损，又不能得到修复，p53蛋白将启动促凋亡程序，促使该细胞发生凋亡。p53蛋白也是一种核磷酸化蛋白，由393个氨基酸组成，在体内以四聚体的形式存在，半衰期为20～30 min。p53蛋白包含4个主要功能域，其参与调控细胞周期、DNA修复和细胞凋亡等过程。p53蛋白是一种对基因毒素类药物有效的介质，并通过转录调控发挥作用。应用基因毒素类药物后，p53蛋白通过一些后转录机制导致其含量增加。有趣的是，突变型细胞中p53蛋白对顺铂更容易产生耐药性。DNA的特异性序列与p53蛋白发生结合是p53蛋白发挥抑制肿瘤生长作用的关键机制，人类基因组中活化的p53蛋白与大约100种不同的信号分子发生结合。通过研究顺铂修饰DNA与野生型人p53蛋白的相互作用发现，p53蛋白可以与顺铂-DNA复合物结合，亦可与反铂-DNA复合物发生作用。