药检技术方面的某些进展
检查尿液中某些化学成分，是医学临床化验学上已经基本解决了的问题，特别是对于像刺激剂，麻醉止痛剂，利尿剂等，临床上都有一套现成的常规手段来检测。但对于雄性激素合成类固醇的检测较为困难。因为使用这一类兴奋剂可以在比赛前一星期左右停药，待实施检测时，体内起过作用的药物已代谢完毕，难以测出。而且，其中一些种类的合成类固醇在体内还可以睾酮形式进行代谢和排泄，因此很难区分所检测到的是内源性睾酮，还是由外界摄入体内的睾酮。特别是新近出现的内源性物质摄入法，更使检测遇到了相当的难度。目前经专业技术人员的潜心研究，对大部分类固醇的检测都找到了解决手段。对那些尚未完全解决的某些内源性物质的检测，也有了一些端倪，并正在迅速的进展之中。
1.刺激剂和麻醉止痛剂的检测
（1）药物的代谢
这几类药物被吸收进入人体内后，可以其原形和代谢产物两种形式存在。药物进入体内后经过化学反应所产生的新物质，称为其代谢产物。药物在体内代谢主要是在肝脏中进行的，因为肝脏中含有多种生化反应的催化剂——酶。
在相关酶系的催化下，药物以4种途径代谢。
第一是氧化：许多药物在体内借助于肝细胞微粒体羟化酶来激活分子氧，而使药物进行氧化，实质上就是在药物的分子结构中增加羟基，所以有时又称为羟基化。第二是还原：有些药物在体内脱氢酶等催化剂的参与下进行还原反应，即与氧化相反的过程，或去氢反应。第三是水解：有些含有酯基和酰胺基的药物，可以在肝脏的酯酶和酰胺酶的作用下被降解，由大分子变为若干个小分子物质。第四是结合：有不少药物进入体内后与体内的一些物质相结合，变成比原形更大的分子结构。例如，像吗啡之类的兴奋剂，含有酚羟基或醇基等，就很容易与体内的葡萄糖醛酸结合，排泄时也以这种结合形式排出体外。
刺激剂类和麻醉止痛剂类的药物，在体内的主要代谢形式是结合。因此一般代谢物的分子极性大于原形分子的极性，这主要是分子结构中羟基等极性基团增加了，这些基团又与体内的葡萄糖醛酸等相结合，再形成水溶性的产物，经肾脏随尿液排出体外。判断运动员是否服用了刺激剂麻醉止痛剂之类的药物，主要是根据其尿液中相关代谢产物的测定浓度。
（2）尿样成分的提取
原始尿样搜集来以后，首先要提取尿中的药物成分。尿成分的提取分离对分析结果的影响很大。
一般是采用溶剂-溶剂法提取，较有效的方式是同一样品在不同酸碱条件下分别提取，以适应不同类型的药物成分。多种有机溶剂，像乙醚，三氯甲烷，二氯甲烷，异丙醇等都可用作提取剂，单独或混合使用。提取的目的是利用提取剂尽可能减低水分含量。
溶剂本身必须有一定的化学稳定性。对于易溶于水而不易溶于乙醇的亲水性强的药物类，可用与水能互溶或部分互溶的有机溶剂；对中等亲水性的药物类，可在上述溶剂的基础上加入氯仿、苯、石油醚、醋酸乙酯等非极性溶剂；对于芳香族及杂环合化物类药物，可在溶剂中加入酸、碱或盐；对于易溶于石油醚而不溶于水的脂类药物，可加用石油醚及烃类，或将溶剂中的水全部或一部分以甲酰胺或乙二醇替代。总之，在某一条件下较完善的溶剂系统在另一情况下未必完全适用，因此不存在绝对的最佳溶剂系统，而必须根据情况，调整溶剂的组成。一般认为，对游离的苯丙胺类、麻黄碱类和游离的吗啡类兴奋剂，其提取方法区别不大，但是对与葡萄糖醛酸相结合的吗啡类代谢产物的提取，必须先经过酸解程序的处理，即将药物成分与葡萄糖醛酸脱开。
比溶剂-溶剂法提取更有效，也是目前采用较多的方法是利用Amberlite XAD-2法，即利用一种乙烯和乙二烯基苯的共聚物树脂，以柱层析等手段提取尿样。
（3）衍生物的制备
在生化检测中，试样成分的特点是分子量较大，沸点（或熔点）较高，挥发性低，热稳定性差，而且大多数分子都带有羟基、羧基或胺基等极性基团，这就给检测和结果分析带来了一定的困难。为了解决这一问题，常常采用化学方法使尿样中的一些成分转变成相应的具有挥发性的衍生物，以降低其极性，增加蒸气压或热稳定性，再进行色谱分析。
制备衍生物时最常用的是甲酯化法，还有重氮甲烷法和季胺盐法等。对于氨基酸类，则采用三氟醋酐直接酰化，然后再进行重氮甲烷酯化。对于含羧基的有机物，可以用羟基硅醚化法制成硅醚化衍生物，或采用羟基乙酰化法，制成相应的乙酸酯。对于嘌呤和嘧啶碱类的成分，可采用三氟乙酰胺试剂进行硅烷化，也有用三甲基苯基氢氧化胺试剂，使嘧啶碱在汽化室瞬间甲基化等方法制成衍生物。
上述的这些药物成分在兴奋剂代谢过程中普遍存在，因此，相应的制备各种衍生物的方法也是适用的。
（4）尿样成分的分析鉴定
提取后的尿样，再经浓缩和衍生化，最后进行气相色谱或气质色谱联用分析，得出鉴定结果。
所谓气相色谱，是指用气体作为载体或支持物的层析法。所选择的作为药物成分的载体的气体，对于被分析的样品成分来说应该是惰性的，所以在色谱分析中常采用氮气、氢气和氦气等。气相色谱法常用柱层析形式。
柱层析形式是层析法的一种。层析法又称色谱法、色层法、层离法，是一种分离分析法。临床生化检验中，层析法被广泛用于各种物质的分离，定性检测和定量分析。对于复杂的多成分的混合物的分离，它更是一种不可缺少的手段。近年来随着这方面仪器和方法的日益完善和自动化程度的提高，层析法已逐渐发展成生化分析中高效、快速和灵敏的技术手段。
根据所用的支持物的不同，层析法又分为纸层析、薄层层析和柱层析等。其原理基本类似。以纸层析为例，简介如下。
将需要分析的经过提取的尿样滴加在长条形的特殊滤纸（作为承受尿样的支持物）一端的某一点上，然后使此端接触适当的溶剂，但滴样点并不浸入其中。溶剂的选择前文已述。溶剂因毛细管作用而渗入滤纸，并通过滴样点向前移动。这一过程称为展层，是在一个密闭的层析缸中进行的。溶剂槽可位于上方，溶剂沿着倒悬的滤纸向下移行，这称为下行层析（方向相反滤纸垂直向上称为上行层析）。展层时，尿样中的不同成分以不同的速度随着溶剂前移，因而在滤纸上分离开来。展层结束后的滤纸称为层析谱，或称色谱图，滤纸上被分离开的物质往往呈现为散在的斑点。吹干滤纸上的溶剂后，无色的斑点可用适当的试剂显色，再根据色斑的位置和颜色深浅进行定性的和定量的分析鉴定。
在纸层析法中所需要的尿样量极小，而分离效果很好，可以使数十种不同成分清楚地分开。用此方法能对尿中组分进行全面分析，并鉴定出40余种物质。纸层析法是最基本的色谱法。实际应用中往往采取更高级的薄层层析和气相层析进行分离，原理相似，只是所用的支持物不同。
薄层层析法灵敏度较高，可以直接测定尿液中排出的游离型药物成分，因而可省去对尿液中结合型药物成分的水解、提取和浓集等步骤。薄层代替了纸层析法中的滤纸，其材料各异，可以是硅胶石膏薄层等，厚度为0.4～1mm。在薄层层析时，有些情况下尿液甚至不需处理，可直接加在离子交换剂的薄层上。尿量用2～10ml，加尿液时辅以热吹风帮助水分蒸发。这种离子交换剂可以除去尿中的强酸和色素物质，使药物不同成分在硅酸石膏薄层上分离开来，再根据色谱定性和定量。
气相色谱属于柱层层析法。程序复杂一些，但分离能力极高，速度也很快，每小时可测定40个样本，特别是在类固醇药物及其代谢产物的尿成分测定中有重要价值。
（5）尿样常规检测分析的程序
早在1969年，国际奥委会医学委员会主席Beckett博士等就总结了他们对尿中碱性药物及其代谢产物的检测和鉴定研究，并将其方法用于以后的几次国际体育大赛中。当时的药检分析步骤如下。
第一步 筛选
①气相色谱筛选
②薄层筛选士的宁
出阳性结果的，进入下一步。
第二步 确证
①进一步的气相色谱分析
②制成衍生物，再进行气相色谱分析
③薄层分析
第三步 其他信息
如裂解气相色谱
气质联用
气层-红外联用
在这3个步骤中，仅第一步是常规分析所必需的，利用4种不同的色谱柱。此法在服用正常剂量的药物后48小时内可检出每毫升0.1μg。在第二十届奥运会上，使用这种方法检测时，灵敏度为每毫升尿液1～200μg。
药检技术的一大进展是将大规模筛选尿样的仪器检测数据与计算机连接操作，每天可以测定500份尿样，扩大了检测的批量规模。药检的另一大进展是将气相色谱与气质质谱联合使用，增强了鉴别的特异性。几种方法并用，可以提高分辨率。近年来，在使用柱层层析时，已开始用毛细管取代填充柱，因而气相色谱法检测的高效率，样品需要量小以及提取过程简化等优点更为突出。
2.同化激素类兴奋剂的检测(https://www.daowen.com)
（1）同化激素类药物的代谢
同化激素类药物不论在分子结构上还是在药理作用上，都与刺激剂类药物有很大区别。它们具有长效作用，运动员多在训练过程中单独或联合使用，而到赛前一周左右，反而停药。因此对这类药物的检测较为困难。特别困难的是，这些药物在代谢过程中其化学结构往往转化为与机体内源性物质相同或相似的形式，这样就更难以在检测中被鉴别出来。
同化激素，即雄性激素蛋白合成类固醇，进入体内后，在产生药理作用的同时，进行正常代谢。代谢的主要部位在肝脏。在其他组织，如肾脏、肌肉、皮肤、小肠及淋巴组织等处，也有不同程度的代谢。不同种类的同化激素，其代谢产物也不同。总起来说，同化激素的代谢产物中包括：睾酮、双氢睾酮、表睾酮、雄酮、异雄酮、雄烯二酮以及其他类型的17-酮类固醇。
以睾酮为例，它的代谢途径主要有3种。首先是睾酮可在某些性器官中由细胞内的5α-还原酶还原成双氢睾酮，以后进一步被代谢为雄烯醇；其次，睾酮还可在外周组织中被转化为雌激素，如雌二醇与雌酮；当然，更大量的睾酮是在肝脏内被还原，并在17β-羟脱氢酶的作用下转变为17-酮类固醇，其中有雄酮、异雄酮及原胆烷醇酮。它们再与葡萄糖醛酸或硫酸结合，形成水溶性较强的四氢或六氢类固醇葡萄糖醛酸苷，而随尿液排出体外。
因此在同化激素的测定中，首先遇到的问题是对收集后的原始尿样的提取。因为代谢产物种类多，比较复杂，且常以结合形式存在，这就需要进行解离。另一方面还要与自身的雄性激素及其代谢产物相区别。
（2）尿样成分的提取
尿中排出的同化激素代谢产物中，哪些是以游离的形式存在，哪些是以结合的形式出现，这关系到所使用的提取方法。这个问题已基本得到了解决。Donike等在对同化激素体内代谢过程的研究中得出结论，认为在含有19个碳原子的代谢产物中，如果第17位碳原子上有烷基，则多以游离型排出体外，如果第17位碳原子上没有烷基，则以结合型排出体外。根据这一原理，建立了两种相应的提取方法。
对结合型的代谢产物，首先要进行酶解。尿样加醋酸调至pH值为4.5的较强酸性程度，再加入0.5ml含有葡萄糖醛酸解酶和硫酸酶的合液，在37℃下维持24～48小时，再经过KOH调液使pH值升至5.5，最后再用有机溶剂提取。酶解这一步需要花费几天的时间，这使得同化激素的分离测定不可能“立等可取”。
因为同化激素药物分子中含有羟基，所以还要在提取时使用三甲基硅烷处理，以便使被检测的成分具有被吸附性，有利于进行下一步的柱层分离和鉴定。尿样提取过程的优劣，直接影响到检测结果的准确性。
（3）鉴定和分析
尿样提取和预处理完毕后，用气相色谱仪（或层析仪）进行单峰扫描、重复扫描或进一步用选择性离子检测的质谱方式作出鉴定。
气相层析仪主要由以下几个部分组成：①载气和辅助气的流量及压力的测量装置；②进样器及层析柱；③检测器；④微电流放大器及记录仪。大致操作程序如下。
检验时，将经提取过的尿样放入进样器，尿样通过层析柱的柱头（柱温50℃）进入，首先在层析柱上形成液相，然后气化。检测器是一种氢焰离子化装置。由层析柱中馏出的物质和燃烧的氢气在喷嘴前混和后，以空气为助燃剂进行烧燃，样品成分在火焰中破离子化，产生了数目相等的正离子和电子。由于收集极与发射极之间有高压，离子在收集极被收集，产生的电流通过高电阻，高电阻的两端获得的电压降经过放大器作阻抗变换后，电记录仪记下层析的波形图。下图为工作状态的简单流程示意。
记录的波形出来之后，可以根据相关波峰的面积来进行对尿样中某些成分的定量分析，计算某成分百分含量P的基本公式为：
气相层析装置工作流程示意图
（4）放射免疫法的应用
在有些特大规模的体育赛事中，如果需要测千数以上的尿样，对同化激素类药物的筛选工作往往要借助于放射免疫方法来进行。
这一方法是基于同位素标记的抗原抗体反应，结果为阳性的才继续做气质分析。常使用的抗血清中含有甲基睾酮的3-（氧-羰甲基）肟衍生物和去甲睾酮的3-（氧-羰甲基）肟衍生物。由于放射免疫测定的灵敏度比气相色谱法的灵敏度要高60倍，所以一般不需要对尿样进行酶解预处理以释放出结合的同化激素。因此在大批量测定时非常方便，省去了很多时间。但是用放射免疫测定法检测兴奋剂时，其技术指标的分析只能限于定性目的，最终的定量分析确认还是要用气相色谱和质谱分析的联用。但在大规模尿样测试中，并非所有的尿样均为阳性，一般阳性者只占很小的比例，所以先用放射免疫法进行粗检后，再对阳性者用气质谱联用来进行细检。这样既节省了人力、物力、财力和时间，而且也不影响检测的准确性。
总之，对于大部分同化激素药物的检测，目前已有一套比较系统的程序了，可以概括如下。
程序1.搜集原始尿样；
程序2.用XAD-2树脂吸附尿中脂质成分；
程序3.用甲醇解吸尿样；
程序4.在pH为5.2的缓冲条件下，用醚将游离激素与结合激素分开；
程序5.对结合型激素进行酶解，然后再提取被游离出来的激素；
程序6.对二步提取物分别进行衍生化反应；
程序7.分别对西类衍生物进行气相色谱和质谱联用扫描；
程序8.对记录波峰作计算定量分析。
在1984年洛杉矶奥运会上，对同化激素的分析检测，就开始使用了上述这一套程序，并对每种药物或代谢产物用至少3种离子质量进行扫描，对得到阳性结果的样品再重新进行第二次复检，然后收集全部质谱图分析，以确认某一药物是否被尿样的主人所服用。这一套程序实践证明是比较成功的。例如对口服大力补的运动员，即使在其停药后8周内都可以查出其阳性结果；注射癸酸诺龙后，甚至在停药后6到8个月时仍可以查出。这就保证了很高的阳性检出率。当然测定的灵敏度与测定时间的早晚，使用药物的剂量和持续时间的长短，以及与体脂百分率和血液的容积有关。
3.其他兴奋剂的检测
关于其他兴奋剂，检测方法的研究，目前主要集中在两方面，一是对于血液兴奋剂的检测，二是对于内源性激素类药物的检测。
（1）血液兴奋剂检测技术进展
虽然一般性地测定人体的红细胞数量、压积以及血红蛋白的含量都是很简单的临床化验操作，但是很难根据测定的值来判断，上述指标数值的升高，究竟是运动员原先的浓度水平高，还是由于高原训练后适宜反应的结果，还是使用了血液兴奋剂所造成的。
瑞典研究者发现，在使用血液兴奋剂后24小时内，不仅有红细胞数量、压积和血红蛋白的显著升高，而且伴有其他的重要血液成分变化：血清红细胞生成素减少60%；运动试验中血清铁和胆红素显著上升。如果动态性地对血红蛋白、血清红细胞生成素、血清胆红素和血清铁进行综合评价，则有利于作出是否使用血液兴奋剂的判断。特别是血清红细胞生成素。因为如果是运动员原先的血红蛋白等指标就比较高，那么一般不会伴有血清红细胞生成素的显著下降，因为其内分泌没有受到影响。但如果是外源性地使用了血液兴奋剂，则可能由于红细胞的增多而负反馈性地抑制了红细胞生成素的分泌，表现为其浓度的显著下降。
瑞典研究者们还指出，用上述指标来检测血液兴奋剂使用者，可以在第一周内通过一次测试，就能在血液兴奋剂使用者中检出一半的阳性率，倘若在前2周内进行2次测试，则可用血红蛋白的增加超过5%和血清红细胞生成素降低超过50%这两项指标为界线，而在血液兴奋剂使用后的2周内，获得50%的阳性检出率。如果这一研究成果进一步提高，血液兴奋剂的检测可望彻底解决。
（2）某些内源性物质的检测进展
关于内源性物质的检测，在本书第七章第二节中已有叙述。这里再就新近的进展作一些补充。
新近，对双氢睾酮的检测有了比较完整的方法。作为一种内源性物质，除检测双氢睾酮本身在尿液中的绝对含量以外，同时检测双氢睾酮的代谢产物5α，3α雄二醇，雄酮等与睾酮的代谢产物5β，3α雄二醇的比值，是鉴定外源性使用双氢睾酮的佐证。此外，双氢睾酮与黄体生成素比值的测定，也可以用来鉴别运动员是否使用了双氢睾酮。因为使用双氢睾酮以后，尿中的双氢睾酮增高，而黄体生成素的分泌却减少，这样就造成了尿中双氢睾酮与黄体生成素比值的升高。
对于促性腺激素这类内源性物质而言，因为它们是属于肽类激素，而一般的气质联用法不可能对肽类物质进行定量分析。但目前正在研究的用气相色谱与质谱的新接口（即高效液相色谱与质谱联用），以及用新的电离方法（例如电子轰击和电喷雾法）后再用质谱来进行定量地测定极性的，带电荷的高质量分子的促性腺激素。但目前这些方法仍处于实验阶段，离作为正式检测方法在体育比赛时使用，还有相当的距离。其主要原因是，代价成本太高，技术也不够成熟以及灵敏度还比较低等。所以，在现阶段还没有国际奥委会认可的肽类激素检测分析技术，于是像黄体生成素和绒毛膜促性腺激素之类的内源性药物的禁用，也仅仅停留在道义上，尚未正式列入禁用药品的名单。
对于另一种内源性物质红细胞生成素，目前也还没有成功的检测手段。但专家们正在从几个方面着手努力，以期在尽可能短的时间内建立起有效的检测方法。
比如，红细胞压积容量明显或异常的增加在红细胞生成素的检测中可能有一定价值，氧分压的升高意味着氧的携带者血红蛋白分子的增多，这就必然会反映为红细胞压积容量值的改变；当红细胞生成素刺激红细胞生成的时候，因为血红蛋白合成增加，必然使更多的可溶性转移受体将参与铁离子的转运。一旦血红蛋白分子合成完毕，就不再需要可溶性转移受体，这样受体的片段就会释放到血循环中去。于是有人考虑，特异性铁转移受体的定量分析将可能提供使用红细胞生成素的证据，因为它直接反映了红细胞生成素对红细胞系统的作用；红细胞生成素的使用还可以从尿中纤维蛋白和纤维蛋白原的降解产物来检测，因为它们二者在凝血系统中起拮抗作用；当然直接测定尿液中红细胞生成素的排出量是否超出正常内分泌的水平，也可以用来鉴别外源性使用红细胞生成素的依据。不过在确定这些物质的正常生理范围的问题上，也有一定的难度，这包括要确定正常人安静状态下的浓度，处于高强度运动状态下的浓度，以及大剂量服用以后异常浓度之间的界限。